气相色谱-质谱法测定温室大棚土壤中13种有机磷酸酯

桑永珠，厉文辉，刘杰民，曲 琛，赵研君，蔡寒梅，洪思程

(1.国标(北京)检验认证有限公司，北京 100088；2.北京科技大学 化学与生物工程学院, 北京 100083；3.中国建材检测认证集团有限公司，北京 100024)

有机磷酸酯(OPEs)具有优良的阻燃和增塑性能，广泛用于聚氯乙烯塑料、电子产品和建筑材料等产品[1]，但大多数OPEs通过物理添加而非以化学键合的方式作用于产品中，极易释放进入环境中，在大气[2-3]、水体[4-5]和土壤[6-7]等环境中均有检出。毒理学研究表明，多种OPEs对生物体具有神经毒性、致癌性和内分泌干扰效应[8]，如氯代OPEs在环境中具有较高的持久性和生物富集性[9]，可能具有比溴代阻燃剂更强的细胞毒性和神经毒性[10]；磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)已被欧盟列入第二类致癌物[11]；磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCP)、磷酸三(1-氯-2-丙基)酯(TCPP)和磷酸三丁氧乙酯(TBEP)可能具有潜在的致癌性[12-13]；磷酸三正丁酯(TnBP)和磷酸三苯酯(TPhP)会干扰生物体内分泌系统，同时破坏生殖功能和神经发育系统[14]。土壤是各种污染物的重要聚集处，温室大棚大量使用塑料薄膜[15]可能增加土壤中OPEs的污染风险，OPEs会由植物通过土壤吸收和积累，从而转入食物链中，进而威胁人类健康。因此，建立温室大棚土壤中OPEs的分析方法具有重要意义。

目前，农田土壤中OPEs检测报道[16-18]前处理方法有索氏提取法[16,19]、超声提取法[17,20]、微波辅助提取法[21]、加压溶剂提取法[22-23]等。但传统的索氏提取法有机溶剂消耗量大、提取时间长；超声提取法花费时间短且溶剂消耗量少；微波辅助提取法虽耗时短、溶剂用量小，但其提取效率受溶剂影响较大。基于此，本研究采用超声提取/气相色谱-质谱法对温室大棚土壤中的13种OPEs进行测定，并对提取溶剂、提取方式、提取时间、萃取柱种类、色谱条件等参数进行优化，将建立的方法用于实际温室大棚土壤样品中13种OPEs的测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)，KQ-300DE超声波清洗仪(昆山市超声仪器公司)，Sigma3-18K离心机(德国Sigma公司)，ZWY恒温振荡仪(上海智城分析仪器制造有限公司)，HGC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)，FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，Trace ISQ气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scienetific公司)。

甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯,美国Fisher公司)，正己烷、乙酸乙酯(色谱纯,中国百灵威公司)。标准品：磷酸三乙酯(TEP)、磷酸三丙酯(TPrP)、磷酸三正丁酯(TnBP)、磷酸三异丁酯(TiBP)、磷酸三丁氧乙酯(TBEP)、磷酸三(2-乙基己基)酯(TEHP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)、磷酸三(1-氯-2-丙基)酯(TCPP)、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCP)、磷酸三苯酯(TPhP)、磷酸三甲苯酯(TCrP)、磷酸甲苯二苯酯(CDPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)均为德国Dr.Ehrenstorfer GmbH产品。内标物：磷酸三乙酯-D15(TEP-D15)、磷酸三丙酯-D21(TPrP-D21)由加拿大C/D/N Isotopes Inc.提供;磷酸三正丁酯-D27(TnBP-D27)、磷酸三苯酯-D15(TPhP-D15)由美国Cambridge Isotope Laboratories提供;磷酸三(1-氯-2-丙基)酯-D18(TCPP-D18)由加拿大Toronto Research Chemicals Inc.提供。

图1 采样位置Fig.1 Sampling location

标准物及内标物储备液：单标储备液(1 000 mg/L)采用甲醇配制，再将13种OPEs的单标储备液用丙酮稀释成混合标准储备液(50 mg/L)。内标物储备液：TEP-D15、TPrP-D21及TnBP-D27采用甲醇配成1 000 mg/L，TPhP-D15及TCPP-D18采用甲醇配成500 mg/L的内标物储备液，再采用丙酮将2种不同浓度OPEs内标液制成300 μg/L内标混合液，并于-20 ℃保存备用。

1.2 样品采集

采样地点选择北京市具有代表性的蔬菜供应基地(图1)：平谷区、昌平区及大兴区的5个蔬菜大棚生产基地，根据每个大棚的实际面积划分采样区域。按照梅花采样法进行采样，采集温室土壤混合样(5个子样品)，采样深度0～10 cm。采集41份土壤样品，其中平谷区(PG)7份，昌平区13份(第一个大棚CP1：9份，第二个大棚CP2：4份)；大兴区21份(第一个大棚DX1：14份，第二个大棚DX2：7份)。将采集的温室大棚土壤用铝箔纸包裹运回实验室。于-50 ℃、真空度为-40 Pa条件下冷冻干燥处理，过60目(0.25 mm)不锈钢筛筛分。将制备好的土壤样品置于-20 ℃下冷冻储存。

1.3 样品前处理

准确称取3.0 g土壤于50 mL离心管中，加入30 mL正己烷-丙酮(体积比1∶1)提取液，再加入50 μL(300 μg/L)内标混合液，涡漩混匀，超声提取20 min，以5 000 r/min离心5 min，转移上清液至50 mL离心管中。再加入10 mL提取液重复提取一次，离心合并上清液，氮吹浓缩至近干，加入1 mL正己烷进行溶剂置换。ENVI-Florisil柱先用2.5 mL甲醇、10 mL乙酸乙酯-丙酮(体积比7∶3)混合液、3 mL正己烷洗涤活化，再以3 mL/min流速上样，3 mL正己烷洗涤，最后用10 mL丙酮洗脱。将经过ENVI-Florisil柱的洗脱液在38 ℃下用轻缓氮气吹至近干后，用丙酮定容至0.5 mL，离心过滤，待气相色谱-质谱法检测。

1.4 仪器条件

本文参照文献[6,17]方法并对仪器相关参数进行了部分改动。

1.4.1 色谱条件色谱柱：DM-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气(纯度>99.999%)，流量1 mL/min，前进样口温度280 ℃，传输线温度280 ℃，不分流模式进样，进样量1.0 μL。升温程序：初始温度60 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升至150 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升至250 ℃，再以2 ℃/min升至270 ℃，最后以15 ℃/min升至300 ℃，保持2 min。

1.4.2 质谱条件电离方式：电子轰击离子化源(EI)；电离能量：70 eV；测定模式：选择离子监测模式(SIM)；离子源温度280 ℃。其余质谱信息见表1。

表1 13种OPEs及5种内标的质谱参数Table 1 MS parameters of thirteen OPEs and five interanl standard substances

2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

样品的提取效率主要受提取溶剂、提取方式和提取时间等因素的影响。由于13种有机磷酸酯极性范围广，为保证较好的提取效率，需选择合适的提取溶剂。实验参考文献方法[14,24]考察了正己烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷-丙酮(体积比1∶1) 4种不同极性提取溶剂对13种OPEs的提取效率。结果发现，正己烷-丙酮(体积比1∶1)对目标物的回收率为73.0%～110%，提取效率最佳。因此，选择正己烷-丙酮(体积比1∶1)为提取溶剂，提取溶剂体积参考文献[25]。

向温室土壤样品中加入30 mL正己烷-丙酮(1∶1)，比较了振荡提取(35 ℃、150 r/min在摇床中振荡12 h)及超声提取(涡漩振荡1 min，超声提取20 min，5 000 r/min离心5 min，重复提取2次)的提取效率。结果显示，振荡提取12 h和超声提取20 min对13种有机磷酸酯的提取效率分别为62.3%～119%和54.8%～121%，提取效率相近，但振荡提取液颜色较浑浊且色谱图杂峰较多；而超声提取用时较短，且色谱峰干扰少，因此采用超声提取温室大棚土壤样品中的OPEs。另外，实验还考察了不同超声时间(10、20、30、40 min)的提取效率。结果发现，温室土壤中OPEs的回收率随着超声时间延长而增大，但超声20 min后，OPEs的回收率不再提高，反而有所下降，这可能是因为超声时间过久，使得溶液温度升高导致部分OPEs损失。另外，文献研究显示，采用超声提取时，提取2次可有效提取目标物[26]。因此本实验选择超声提取20 min，提取2次。

2.2 净化条件优化

由于土壤有机质含量高，基质复杂，提取后需净化方能上机测定，常采用固相萃取柱净化，但不同类型的固相萃取柱净化效果差异较大。本研究参照相关文献[27]，考察了Oasis HLB(6 mL，200 mg，Waters)、ENVI-18(6 mL，500 mg，Supelco)及ENVI-Florisil (3 mL，500 mg，Supelco) 3种商品化固相萃取柱对目标物的净化效果。结果显示：ENVI-18小柱对极性较弱的EHDPP提取率仅为20%左右，HLB柱对多种目标物的提取效率(54.6%～122%)虽高于ENVI-18小柱，但较Florisil柱的提取效率(94.3%～130%)低。因此，实验采用Florisil小柱净化。

图2 混合标准溶液的选择离子色谱图(100 μg/L)Fig.2 SIM chromatogram of a mixed standard solution the peak number 1-13 were as same as those in Table 1

2.3 色谱条件优化

本研究首先对升温程序进行了优化(见“1.4”)，实现了13种OPEs的分离完全。另外，还对进样方式和进样体积进行了优化，以便获得更好的灵敏度。结果发现：采用不分流进样时，有足够量的目标物进入色谱柱，灵敏度比分流进样高。在不分流条件下，采用5 μg/L的13种混标溶液考察了进样体积分别为1.0、1.5、3.0 μL时的灵敏度，发现进样体积为1.0 μL时，多数目标物的灵敏度比文献[17]高。因此，本研究在m/z为50～650条件下，不分流进样，进样体积为1.0 μL。对13种混合标准物(100 μg/L)和5种内标物(30 μg/L)进行分析，得到其总离子流图(图2)，图中各OPEs的谱峰完全分离，峰形对称而尖锐。

2.4 线性范围、检出限与定量下限

实验配制了0.5、1、5、10、20、50、100、200、500 μg/L的13种OPEs的混合标准溶液，在优化条件下检测，以待测物的质量浓度为横坐标，对应化合物的峰面积与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线；以3倍信噪比(S/N=3)计算方法的检出限(LOD)，以S/N=10计算定量下限(LOQ)。结果显示，13种OPEs在1～500 μg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数(r2)为0.999 3～0.999 7;LOD为0.04～2.31 μg/L，LOQ为0.13～7.69 μg/L(表2),低于文献(6～200、0.09～11.7 μg/L)报道[16-17]。

2.5 回收率与相对标准偏差

向土壤样品中添加低、中、高3个质量浓度(1、10、50 μg/L)的加标溶液，每个水平平行6次，在优化条件下测定，土壤中各化合物的回收率和相对标准偏差(RSD)结果见表2。13种OPEs的回收率为54.5%～130%，RSD为1.7%～9.9%，表明方法准确性好,精密度高，可用于温室土壤样品中13种OPEs的测定。

表2 土壤样品中13种OPEs的线性范围、相关系数(r2)、回收率、相对标准偏差、检出限与定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficient(r2),recoveries,RSDs,LODs and LOQs of 13 OPEs in soil samples

2.6 实际样品测定

采用本方法在优化条件下对采自北京地区的41个温室大棚土壤样品进行检测，结果见表3。由表3数据可见，除TPrP外，其余12种OPEs均有检出，含量为1.90～632 ng/g(干重)，平均值为87.8 ng/g，中位值为39.7 ng/g。其中TCPP的检出率最高(80.5%)，其次为TDCP(78.0%)，这两种物质均为通常具有较强生物毒害性的氯代有机磷酸酯；TBEP是温室大棚土壤中主要OPEs污染物(检出率为58.5%，含量为0.19～48.0 ng/g)，检出量约占检出的12种有机磷酸酯总含量(∑12OPEs)的20%，与河北省塑料垃圾处理区土壤[16]和重庆城区表层土壤[27]研究结果一致，这是因为TBEP常被用于塑料农膜中的增塑剂。由此可见，OPEs在大棚土壤中的大量检出应引起相关部门重视。

表3 温室土壤中OPEs浓度水平和检出率Table 3 Concentration and detection rates of OPEs in greenhouse soil

3 结 论

本文建立了超声提取/气相色谱-质谱法检测大棚温室土壤中有机磷酸酯的分析方法，在最佳实验条件下，13种OPEs的回收率为64.2%～130%，相对标准偏差为1.7%～9.9%。对北京地区大棚温室土壤样品中有机磷酸酯的检测发现，除TPrP外，其余12种OPEs均有检出，其中2种具有致癌效应的氯代有机磷酸酯在温室土壤中普遍检出，需得到人们的重视。该方法操作简便、灵敏度高、准确性好，适用于温室土壤中有机磷酸酯的检测。