环状RNA及其对肿瘤作用的研究进展

刘建林,赵小蓉,汪萍,刘康,别俊

1川北医学院,四川南充 637000;2南充市中心医院

环状RNA(circRNA)是一类由mRNA 3′及5′末端首尾相连形成的无蛋白编码功能的RNA分子，主要由内含子或外显子通过反向拼接或套索内含子的方式产生[1]。长期以来，限于检测技术的制约，circRNA被认为是转录后加工过程中的错误产物，并未引起重视。随着测序技术的发展，发现circRNA广泛存在于真核细胞中，且稳定表达，在人类细胞基因表达调控中起重要作用[2]。目前研究表明，circRNA在很多肿瘤中存在异常表达，且与肿瘤分期及类型存在相关性[3]，提示其在肿瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用，有望为肿瘤的诊断、治疗提供新的思路。circRNA在肿瘤中的作用已成为非编码RNA家族中新的研究热点。现对circRNA的形成机制、生物学特征、功能及其在肿瘤中作用等方面进行阐述。

1 circRNA

1.1 形成分类及特征 circRNA主要有内含子环化和外显子环化两类形成方式。根据生成合成机制circRNA可以分为三种类型：外显子circRNA、内含子circRNA和外显子—内含子circRNA。目前成环机制有：在mRNA前体上，连续的组装小核糖体蛋白催化外显子下游的5′供体位点连接到上游的3′受体位点，首尾插接形成环化，通过剪切形成circRNA；部分circRNA外显子两侧内含子中含有反向互补序列，在剪切位点上形成RNA双链，通过可变剪切形成带内含子和不带内含子两种circRNA；RNA结合蛋白(RBPs)是一类涉及基因转录和翻译的蛋白，是circRNA的基本功能元素，通过将RPBs结合到外显子侧翼的内含子上，促进circRNA的形成。不同于线性RNA，circRNA是共价闭合的单链环状RNA分子，无5′帽和3′poly(A)尾巴。这种结构特征使得circRNA对核糖核酸酶[如核糖核酸外切酶R(RNase R)和核酸外切酶]的消化具有抗性，相比线性mRNA的稳定性更高、半衰期更长[4]。此外，研究还发现，circRNA多由外显子组成，少数由内含子环化形成，在物种间进化上具有高度保守性[5]；且在一定组织细胞来源及不同发育阶段中具有时序特异性[6]。

1.2 功能 研究发现circRNA可充当miRNA海绵，从而发挥生物学作用[7]。circRNAs是一类竞争性内源RNAs，可以与miRNA结合而在转录后水平上影响miRNAs的稳定性和转录，导致miRNA相关靶基因表达水平发生改变[8,9]。同时circRNAs通过多种途径参与调控基因转录。研究发现，部分外显子—内含子circRNA可以与U1小核糖核蛋白(snRNP)相互作用，通过与RNA聚合酶Ⅱ结合，促进亲本基因转录[10]。剪接因子外显子可以环化形成circRNA，它与前体mRNA的线性剪接竞争，影响线性RNA的形成，起到调节相关基因表达的作用。此外，circRNA作为非编码RNA，被认为无法依靠帽子相关翻译机制进行翻译，并且，先前的多核糖体梯度分析和核糖体谱分析表明，大多数circRNA与多核糖体无关。然而最近一些研究通过构建了一个包含无限阅读框的环状RNA，证明这种circRNA可以模仿原核生物中RNA翻译进行DNA滚环扩增(RCA)[11]，这提示circRNA可以编码蛋白质，具有翻译功能。

近来研究发现，circRNA参与细胞信号传导途径，例如促分裂原激活蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B和Wnt/β-catenin途径[12,13]。作为上游的调节分子，circRNA通过与miRNA竞争释放下游分子而发挥作用。目前已发现circRNA参与肿瘤发生、增殖、凋亡和侵袭等过程，有望通过干预circRNA水平来达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞具有免疫原性，但肿瘤可以逃避免疫监视。实际上，在肿瘤发展的整个过程中，细胞必须克服内部和外部免疫的障碍才能成为肿瘤，只有癌细胞逃脱免疫监视并通过各种免疫逃逸机制克服免疫功能时，肿瘤才能进展或杀死宿主。现有报道指出，circRNA可以用作竞争性内源RNA来帮助肿瘤逃避免疫监视，且在免疫检查点治疗期间，circRNA表达的变化可能会影响治疗的效果[14]，但具体机制尚不明确。

2 circRNA对各类肿瘤的作用

2.1 乳腺癌 Fang等[15]通过微阵列分析了人类乳腺癌和良性组织中circRNA的水平，发现circRNA circ-Ccnb1在癌症样品中被下调。Chen等[16]通过实验表明，三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系中的circEPSTI1(hsa_ circRNA_000479)水平上升，是TNBC患者生存的独立预后指标。上述研究提示异常表达的circRNR有助于TNBC的早期诊断及预后判断。此外，Chen等[16]研究还发现，circEPSTI1作为miRNA海绵，可与miR-4753和miR-6809结合，调节B细胞淋巴瘤/白血病11A基因表达，影响TNBC细胞增殖和凋亡。Gao等[17]研究发现，circ_0006528在TNBC组织和细胞系中过度表达，且与晚期肿瘤淋巴结转移和预后不良密切相关。circ_0006528作为竞争性内源RNA，可通过miR-7-5p海绵作用并激活丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号转导通路来促进TNBC进展。表明circRNA可通过其miRNA海绵作用，影响TNBC相关靶基因的表达及其信号通路，参与TNBC的发生发展。

2.2 肺癌 Dai等[18]发现，circ0006916在恶性转化细胞以及肺癌细胞和组织中下调，其通过与miR-522-3p结合并抑制PH结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶1活性而成为肺癌的肿瘤抑制因子，通过减缓细胞周期进程来抑制细胞增殖。Zhu等[19]报道，hsa_circ_0013958在肺腺癌组织中明显上调，同时被鉴定为miR-134的海绵，能够上调癌基因细胞周期蛋白D1，在非小细胞肺癌(NSCLC)的发生发展中起着关键作用，与TNM分期和淋巴结转移相关。表明circRNA可通过其miRNA海绵作用，参与肺癌的发生发展，并对肺癌的严重程度起预测作用。融合基因是由染色体异常易位引起的两个分离基因的杂交。融合基因棘皮微管相关蛋白样4(EML4)—间变性淋巴瘤激酶(ALK)存在于4%～5%的NSCLC病例中，并通过激活ALK产生致癌活性[20]。融合基因不仅编码与肿瘤发生有关的融合蛋白，而且产生非编码RNA，从而促进肿瘤的发展[20]。例如，混合谱系白血病(MLL)/AF9融合基因(f-circM9)产生的circRNA(F-circEA)就具有促增殖和促癌活性。值得注意的是，F-circEA主要存在于EML4-ALK阳性NSCLC患者血浆中,表明F-circEA可能是诊断EML4-ALK阳性NSCLC患者的潜在生物标志物。

2.3 结直肠癌 circRNR表达谱在结直肠癌细胞系和组织中有显著的丰度变化，与结直肠癌的转移、侵袭、预后等密切相关。Hsiao等[21]研究发现，circCCDC66在结直肠癌中表达升高，并与结直肠癌的不良预后有关。circCCDC66可通过与miR-33b、miR-93和miR-185结合来调节癌基因C-myc的表达。Zeng等[22]研究报道，circHIPK3在大肠癌组织和细胞系中显著上调，并且与转移和晚期临床分期呈正相关。circHIPK3基因敲除可显著抑制大肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并可诱导细胞凋亡，抑制大肠癌的生长和体内转移。上调的circHIPK3可通过增加miR-7靶向原癌基因胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、表皮生长因子受体(EGFR)、阴阳因子1(YY1)的表达，有效逆转miR-7诱导的大肠癌细胞恶性表型的衰减。Li等[23]研究指出，circITGA7在大肠癌中具有肿瘤抑制作用，通过抑制Ras信号通路并促进ITGA7的转录来抑制大肠癌细胞的增殖和转移。

2.4 食管癌 Wang等[24]研究发现，circ-TTC17在食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞和组织中明显过表达，共有20个miRNAs(如miR-153、miR-217、miR-224和miR-370)和相应的靶mRNA与circ-TTC17发生相互作用,并且体外实验表明，circ-TTC17促进了ESCC细胞的增殖和迁移。上调的circ-TTC17有可能成为将来ESCC诊断、治疗和预后的新生物标记物。放疗期间获得的放射抵抗被认为是局部肿瘤复发或治疗失败的最重要原因。Su等[25]调查circRNA在食管癌放射抵抗中的作用，结果发现,与人类亲代细胞系KYSE-150相比，人类抗辐射食管癌细胞系KYSE-150R中有57个circRNA显著上调，而17个circRNA则下调，这些失调的circRNA可能参与了放射抗性的发展。随后的circRNAmiR共表达网络分析表明，circRNA_001059和circRNA_000167是潜在circRNA/miRNA网络中最重要的因素。这些结果提示，异常表达的circRNA与食管癌细胞的抗辐射性有关。

2.5 其他肿瘤 circRNA不仅在实体肿瘤中发挥作用，而且可参与血液系统肿瘤发生发展。Guarnerio等[26]研究发现，在急性早幼粒细胞白血病细胞中，PML-RARa融合基因不仅可以翻译融合蛋白，还可以形成circRNA f-circM9融合蛋白。功能增强测定和功能丧失测定表明，f-circM9发挥原癌基因作用，有助于急性早幼粒细胞白血病中的细胞转化。另外，f-circRNA赋予了体内治疗抗性，并与其他致癌因子(如融合蛋白)协同作用，从而促进癌症的发展。2020年，Wu等[27]首次报道线粒体circRNA促癌功能研究，结果显示mc-COX2是在慢性淋巴细胞白血病(CLL)血浆中高度表达的重要mt-circRNA(线粒体基因组衍生的circRNA)，且在CLL患者的血浆外泌体中高表达。其生物学和临床特征也提示mc-COX2的上调与白血病的发生和CLL患者的生存率呈正相关；功能研究发现，通过沉默CLL细胞中的mc-COX2基因，可以增强抗肿瘤作用。这提示mt-circRNA在CLL中具有促癌作用，且在血浆中表达，为液体活检方面提供了可能。虽然在血液系统肿瘤中circRNA报道较少，但已初步成为血液肿瘤领域研究热点。

综上所述，circRNA通过miRNA海绵作用、蛋白质结合分子、转录调节物、参与肿瘤逃逸及免疫等生物学功能参与肿瘤的发生发展，并与肿瘤预后转归有着密切关系。血浆和组织样品中存在大量的circRNA，circRNA有望成为癌症筛查及临床诊断、治疗和预后评估的生物标志物；未来circRNA在肿瘤早期筛查、肿瘤治疗等领域具有巨大潜力。