胆囊黏膜上皮功能改变在胆固醇结石形成作用的研究

沈惟一 综述 胡海，蒋兆彦 审校

（同济大学附属东方医院胆石病中心，同济大学医学院胆石病研究所，上海 200120）

胆囊胆固醇结石病（简称胆石病）是世界范围内的常见病。成年人的发病率10%～20%。其中约20%病人会在一生中出现症状[1]。胆结石形成与以下几个方面有关：遗传易感性，胆汁中胆固醇和胆汁酸平衡破坏导致胆固醇过饱和，胆囊动力功能障碍等[2]。胆囊是储存胆汁以及结石形成的场所。胆囊尤其是胆囊黏膜上皮对于成石的影响值得研究者关注[3-4]。本文综述胆囊黏膜上皮功能改变对胆囊结石形成的影响。

黏膜上皮吸收功能

一、钠等金属离子的吸收

胆囊上皮细胞顶端有钠氢交换体 （Na-H exchanger，NHE）、钠氯协同转运体（Na-Cl cotransporter，NCC）等多种离子通道。从胆汁中吸收钠最重要的途径是钠氢交换[5]。在胆固醇结晶形成前，胆囊NHE活性已增强，上皮细胞在过饱和胆汁中对于钠的吸收增加2倍。这可能与过饱和胆汁降低蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα,PKCα）的磷酸化活性，使其对正常状况下NHE的抑制调节作用减弱有关[6]。但胆石形成后，胆囊上皮对钠的吸收功能逐渐减弱，最终彻底失去主动吸收功能。NHE的活性降低，同时使胆囊酸化胆汁的功能减弱。胆汁内以离子形态存在的钙不稳定，可能进一步促进胆石增长。人类胆囊上皮顶端只存在NHE-3亚型。成石后，该亚型的mRNA表达量增加，虽然蛋白质表达量不变，但其蛋白质磷酸化程度升高，使真正具有功能的NHE减少，可能导致成石后胆囊吸收能力下降[5]。

二、水的吸收

胆囊吸收水分仅局限于黏膜皱襞顶部且继发于离子转运，尤其是钠离子和氯离子，缺乏任一种都会妨碍对水的吸收。上皮细胞通过细胞膜的自由扩散和膜上的水通道吸收水[7]。胆囊主要表达水通道蛋白 （aquaporin,AQP）1和AQP8。其中AQP8只表达于胆囊上皮细胞顶端。AQP1表达于细胞双侧。虽有报道在转录水平检测到AQP4，但具体定位和功能有待进一步证实，而AQP5被认为在胆囊肿瘤中有重要作用[8]。AQP1受激素调控，血管活性肠肽或胰泌素存在时，由胞内移至顶端胞膜分泌水，而顶端AQP8负责向胞内转运水。在结石形成的早期，黏膜上皮对水的吸收增多，可能继发于NHE早期活性增强，钠吸收增多，进一步浓缩胆汁，加速胆固醇结晶的析出[9]。结石形成后，胆囊对于水的吸收功能减弱。虽然小鼠实验证明胆石存在与AQP减少关联[10]，但在人胆囊，由于研究较少，两者的关系尚不确定[11]。

三、胆固醇的吸收

正常胆囊能吸收胆汁中约30%的游离胆固醇[3]。在胆汁酸盐存在的情况下，胆汁胆固醇与细胞胆固醇自由交换，因此，胆固醇的净流入和流出取决于热动力学稳定。温度降低会减慢胆固醇吸收速度。此外，胆汁中胆汁酸盐的含量和种类通过影响胆固醇微胶粒与上皮细胞之间的表面阻力而改变吸收速度。在结石形成之前，过饱和的胆汁导致胆固醇向上皮细胞膜净流入，胆汁胆固醇浓度高时，虽然吸收比例有所下降，但总体吸收量仍明显上升。胆汁胆固醇过饱和通常伴随着黏膜的胆固醇酯含量增多。这可能是由于上皮中催化胆固醇酯合成的胆固醇酰基转移酶 （acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，ACAT）以及催化胆固醇向胆汁酸方向转化的细胞色素P450家族成员27（cytochrome P450 family 27，CYP27）的活性增加，而水解胆固醇酯的酶（cholesteryl ester hydrolase，CEH）活性并无改变[12]。 但有学者发现ACAT及CYP27的mRNA及蛋白质表达量并不增加，仅酶活性发生改变[12]。此外，胆固醇摄取的关键转运蛋白NPC1L1在结石病人肝细胞中表达减少，尤其女性[13]。该种蛋白质在胆囊上皮细胞的表达变化尚不明确，有待进一步研究。另外，胆固醇极难溶于水。与肠道吸收胆固醇类似，胆囊黏膜上皮对胆固醇的吸收依赖于乳化剂的存在。胆汁酸的甾体核疏水，同时支链富含亲水基团，可与磷脂等其他脂质一起形成微胶粒将胆固醇传递至上皮细胞表面。胆汁中磷脂和胆汁酸盐成分增加，可提高形成微胶粒中的胆固醇量。胆囊黏膜对微胶粒携带的胆固醇更易吸收，导致黏膜脂类沉积。细胞膜胆固醇成分的改变也可改变膜电位，影响细胞功能。这些相关改变均具有促进结石形成的作用。

胆囊分泌功能的改变

生理状态下，胆囊上皮浓缩进入胆囊的肝胆汁，储存至下次进食后。进食后，胰泌素分泌，钠吸收被抑制，同时AQP1受调控由胞质转移至胞膜顶端向胆囊腔内分泌水[9]。不同个体在这种情况下胆汁成分差异不大。在结石形成早期，钠的分泌量并不减少，甚至有所增加，提示这个阶段，黏膜钠的分泌功能并不因结石形成而下降。

胆囊上皮还有较强的黏蛋白（mucin，MUC）分泌能力[5]。这些黏蛋白与钙或磷脂小泡中的胆固醇结合，促进胆固醇结晶聚集和胆石生长。但胆汁中黏蛋白浓度与成核时间之间并无确定关系。过饱和胆汁中的脂类和疏水性胆汁酸（如去氧胆酸）增多，引发脂质过氧化。这些产物（如丙二醛、花生四烯酸）通过炎症诱导表皮生长因子（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路，使胆囊上皮细胞黏蛋白分泌增多[14]。当流入胆囊的肝胆汁变稀薄时，相关黏蛋白分泌量降低[15]。另外，胆石形成往往伴有炎性细胞浸润。这些细胞在黏膜下层分泌 TNF-α（tumor necrosis factor-α），同样可上调EGFR促进黏蛋白分泌。增多的黏蛋白以MUC5AC为主，其他黏蛋白（如 MUC1、MUC3、MUC5B）表达量不变[16]。 有研究表明，黏蛋白与胆囊炎症相关，在棕色胆石形成中起重要作用[17]。

胆囊壁可能存在向胆囊腔内分泌胆固醇的能力。胆石形成时，上皮细胞 ABCG5/8（ATP binding cassette subfamily G member 5/8）的mRNA水平升高，且有实验证明在接触过饱和胆汁时，ABCG5/8会从黏膜细胞内定位移至顶端。另一种胆固醇转运蛋白ABCA1（ATP binding cassette subfamily A member 1）在人类主要表达于上皮细胞基底侧，转运外周组织内的胆固醇和磷脂，防止胆固醇在组织内堆积。其在胆固醇相关胆囊疾病时表达同样升高，分泌至细胞外的胆固醇会吸引巨噬细胞聚集和吞噬胆固醇形成泡沫细胞[18]。

胆囊黏膜上皮形态和成分的改变

一、胆囊黏膜上皮细胞改变

胆囊黏膜根据不同的结石类型和成因而发生改变[19]。在动物成石模型中，胆固醇结石形成最初阶段常有上皮细胞增生和分泌增加。胆囊上皮正常生理状况下的栅栏样排列被打乱，细胞间出现囊泡。这些囊泡可能是上皮细胞分泌的物质，且这种分泌增多的现象早于结石形成。成石之后，胆囊黏膜增厚，固有层水肿，上皮出现凹陷，表面AQP1/8表达下降，细胞DNA合成活跃[10]。这些改变并不只是胆固醇过饱和胆汁及胆石物理刺激的结果。上皮细胞所处的微环境以及与炎症细胞、免疫细胞、成纤维细胞等可能相互作用，共同构成胆囊壁的变化。在体外培养的人胆囊细胞中，同样出现细胞分裂活动旺盛的现象。这些细胞周期动力学上的变化，根据上皮接触到的特定胆汁酸和脂类成分的不同而呈现差异。

二、胆囊上皮基质和炎性因子

胆囊壁炎症也是胆石形成过程中的早期现象，出现于胆固醇结晶形成后、胆石形成之前。T细胞在成石过程中起一定作用。胆汁中胆固醇刺激T细胞，尤其是Th1细胞，分泌IL-1、IFN-γ、TNF-α[20]。 巨噬细胞也被认为参与胆囊炎性反应。TNF-α和IL-1α与CD68（巨噬细胞表面标志）表达呈正相关。在胆石病中TNF-α通过刺激其他炎性因子起胆囊壁炎症始动作用。受IL-1和TNF-α的诱导，IL-6的表达升高，维持炎性环境，促使急性炎症转变为慢性。外环境的炎性因子增加一氧化氮的产生，损伤正常上皮DNA。同时，炎性细胞蛋白酶分解，毛细血管内皮细胞表达TFPI（tissue factor pathway inhibitor），局部血流减少。胆囊上皮细胞的生存微环境恶劣。坏死或凋亡的上皮细胞向胆囊腔内剥落，可能成为潜在的成核因素[21]。

骨桥蛋白（osteopontin,Opn）也被认为参与胆石形成。其是酸性非胶原骨基质蛋白质。充盈型胆石的胆囊壁常能检测到高于正常的Opn表达。甚至出现炎症前，Opn的mRNA和蛋白质水平已升高。胆囊平滑肌细胞、巨噬细胞以及由正常上皮退化而来的立方体上皮细胞表达Opn的免疫活性。在骨组织中Opn的氨基酸序列有较强的钙结合能力，被认为有助于骨矿化。且有实验表明Opn呈网状分布在胆色素结石中[22]。因此，Opn一度被认为是胆石成石的促进因素。近年研究认为，单纯从胆囊的角度看，Opn通过抗成核作用，对胆固醇胆石有预防作用[23]。但Opn通过影响肝脏胆汁酸代谢酶，如CYP7A1[24]或通过肠道胆固醇吸收相关蛋白质（Niemann-Pick C1 like 1 蛋白）[25]促进胆石形成。

三、胆囊上皮间质细胞和炎性细胞

胆石存在时胆囊壁往往有炎症细胞浸润增多，包括肥大细胞、巨噬细胞/泡沫细胞、树突细胞等[26]。喂养高胆固醇饲料的小鼠在成石后，胆囊固有层水肿，成纤维细胞增多。巨噬细胞在炎性浸润中作用显著。形成泡沫细胞和炎性息肉时，都有巨噬细胞的参与。但慢性炎症时，巨噬细胞数量反而减少。

终隔细胞又称特络细胞。间质细胞中终隔细胞主要定位于固有层，与肌层相连[27]。有报道称该种细胞在胆石病时数量减少。胆固醇过饱和胆汁可直接产生细胞毒性作用[28]。其中高浓度胆酸和脂类增加局部TNF-α含量，通过Caspase 8/3诱导凋亡，减少终隔细胞数量。部分胆汁酸成分，如甘氨胆酸和牛磺胆酸，对终隔细胞在胆固醇过饱和胆汁中有保护作用[29]。另外，中性粒细胞浸润也会通过损伤细胞网状结构减少终隔细胞[30]。除数量上的变化，终隔细胞在胆石形成后位置重新分布，从肌层面重分布至固有层近黏膜面[31]。虽然胆石形成时终隔细胞变化明显，但其是否成为影响胆囊收缩的决定性因素仍有待进一步研究[31]。

中性粒细胞在结石形成中起至关重要的作用。其不仅作为浸润上皮的炎性细胞出现，更重要的是其NET（neutrophil extracellular trap）作用。NET是由中性粒细胞崩解，释放出胞外的染色体外 DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA），并组成颗粒蛋白。因此，NET具有包裹病菌或异物的功能[32]。在胆汁中有晶体，局部有活性氧产物存在时，NET就会形成。其起类似网兜的作用，吸附胆固醇和钙沉积于结石上。因此，无论胆囊是否有炎症，结石为色素或胆固醇性，都可从结石上检测到ecDNA。在生理状况下，女性形成NET的水平明显高于男性[33]。这可能是除雌激素外另一个促进女性高胆石发病率的因素。

结 语

胆囊作为消化系统的一部分，主要承担胆汁储存、浓缩等功能。其功能和结构的稳态容易打破，甚至形成恶性循环。成石早期过饱和胆汁刺激钠吸收增多，伴随水吸收增多，胆汁进一步浓缩，析出结晶。这类胆汁刺激黏蛋白分泌，加速上皮细胞增生脱落，促进成核；改变膜电位，使终隔细胞凋亡，削弱胆囊收缩；诱导上皮中一系列炎性反应，产生过氧化产物，形成NET加速结石沉积。结石形成后，长期摩擦胆囊上皮激化炎症，直接妨碍收缩。成石过程中的一系列产物，如炎性因子，活性氧，损害吸收和分泌功能。因此，加强对胆囊黏膜上皮功能及其在成石中作用的认识，对于胆石病防治具有重要意义。