CAR-T细胞疗法：一场新的肿瘤免疫之战

向茂源，张献全

（重庆医科大学附属第二医院肿瘤科，重庆）

1 CAR-T细胞疗法的发展历程

数十年来，肿瘤学家一直致力于潜心专研人体免疫系统的潜在特性。随着对白细胞特性认识的不断加深，免疫疗法之母即同种异体干细胞移植(alloSCT)得到了发展。Kolb[1]于他1998年发表的论文中提出了证据，证明供体淋巴细胞输血可以使复发的慢性髓系白血病患者获得持久缓解。

双特异性T细胞抗体CD19×CD3（the bispecific T- cellrecruiting antibody construct CD19×CD3）也能够清除白血病及淋巴瘤[2]。这些双特异性抗体（BiTE）由两个单链可变片段组成，一个以肿瘤相关抗原为靶点，另一个以T细胞相关抗原为靶点，旨在引导T细胞活化，从而攻击肿瘤细胞。

2 CAR-T的结构及制造方法

不同于传统T细胞受体（TCR），CAR-T细胞对肿瘤的清除不需要与人类白细胞抗原(HLA)结合，而是依赖于嵌合抗原受体（CAR）分子，这可以减少肿瘤细胞中由 HLA表达引起的免疫性逸。同时，CAR-T细胞具有分化成记忆T细胞的优势，由此可建立长期的抗肿瘤活性。

2.1 CAR-T的结构组成

CAR是基因改造的T细胞受体，其结合了肿瘤相关抗原结构域[常由抗体产生的单链可变片段（scFv）]、铰链区、跨膜区和受体的共刺激结构域。免疫球蛋白IgG1、IgG4、IgD和CD8分子形成铰链区，其与scFv的灵活性相关。T细胞的CD3ζ、CD4、CD8、CD28分子形成跨膜区序列。共刺激结构域主要通过CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等分子激活T细胞。

CAR-T细胞至今已发展四代。1987年，第一代CARs由Kuwana提出并设计[5]，彼时的CARs仅具有CD3ζ结构域，它们不能产生足够的白介素-2（IL-2），从而无法启动持续、有效的T细胞反应。随后，第二代CARs出现，二代CARs受益于双信号T细胞抗体，如CD28或4-1BB。当CAR识别肿瘤靶点时，共刺激分子可有效地增强IL-2的合成，增强抗肿瘤活性。第三代CARs增加了更多的共刺激分子，如：OX40（CD134）、CD28、CD27、DAP10等。由于胞内区有2个共刺激信号分子，第三代CARs在体内的增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤力又得到了进一步提高。第四代CARs通过细胞因子分泌的额外转基因(如IL-12)或额外的共刺激配体的修饰，使免疫反应更加激烈，从而使抗肿瘤活性得到增强。

2.2 CAR-T的制造方法

CAR-T细胞的制造是非常复杂、精心控制的程序。该程序包括三大步骤：T淋巴细胞的体外富集、CAR-T细胞的制备、大规模扩展。CAR-T细胞过继治疗是一种以自体细胞为基础的治疗，通过白细胞分离术收集患者的外周血单个核细胞，再分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+ T细胞[6]。

分离出的T细胞起始亚群需要持续和充分的激活才能实现体外扩增。这就需要通过T细胞受体（信号1）和CD28、4-1BB或OX40（信号2）等共刺激信号产生主要的特异性信号，从而激活T细胞。再通过电穿孔、慢病毒或逆转录病毒载体，将CAR基因导入激活的T细胞中进行基因修饰，从而得到可表达CAR基因的CAR-T细胞。其中，慢病毒载体比逆转录病毒载体提供了更安全的基因组整合概况，因此已被广泛用于CAR-T细胞疗法的临床试验中[7]。

对获得的CAR-T细胞进行免疫分型、存活力、内毒素等方面的检测，在确保生产的CAR-T细胞纯度和安全性达到要求后回输给患者，实现CAR-T免疫治疗。

3 目标抗原的选择

嵌合抗原受体（CAR）通过识别抗原，激活T细胞，从而杀死肿瘤。由于相当一部分目标抗原在非肿瘤细胞上也有表达，由此在对抗肿瘤同时也对非肿瘤细胞产生损害，也就是脱靶效应。因此，理想的目标应该具有高覆盖度和高特异性，以确保有效性和安全性。

3.1 血液肿瘤目标抗原

目前，大多数具有良好临床效果的CAR-T疗法都符合高覆盖率的选择标准，例如CD19，CD20，CD22，CD23和B细胞成熟抗原（BCMA）等[8]。

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以CD19为例，由于CD19在B细胞白血病和淋巴瘤中的高覆盖率，它被选为CAR-T疗法中使用最广泛的靶标。靶向CD19的CAR-T细胞对儿童和成人难治复发性B-ALL、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤都呈现出持续高效的抗肿瘤活性，总缓解率在不同研究中维持在70%-94%[9]。

但是，就特异性而言，CD19不是理想的靶标。CD19表达于B细胞，在靶向CD19的CAR-T疗法的抗肿瘤作用下，正常的B细胞也将被清除。因此，CAR-T细胞疗法常见的靶标事件便是B细胞发育不全。幸运的是，近年来随着临床管理的提升，大部分患者可耐受B细胞发育不全。

CD22在成熟的淋巴瘤以及急性B淋巴细胞白血病上高表达，临床结果表明，靶向CD22 CAR-T治疗已带来可观的疗效[10]。CD23在慢性淋巴细胞白血病（CLL）上表达，但在正常B细胞 上不表达，临床研究表明抗CD23 CAR-T细胞对CLL细胞的生长具有一定影响[11]。

CD20和BCMA也是如此。尽管它们并未在肿瘤细胞上严格表达，但由于其高覆盖率和可耐受的脱靶效应，这些靶标已显示出广阔的临床前景。

3.2 实体瘤目标抗原

与血液恶性肿瘤相比，实体瘤具有更加复杂的肿瘤微环境（TME），多种免疫抑制机制和多种生化因素构建的物理障碍使得CAR-T细胞难以找准准确的靶点攻击肿瘤细胞，因此针对实体瘤的目标抗原的研发更加困难。

由于肿瘤特异性抗原（TSA）在实体瘤细胞中有着独特而丰富的表达[12]，它被选为最合适的目标抗原。但是，这些抗原在患有相同类型肿瘤的患者中异质性很高，必须为每位患者确定合适的TSA，再生成特异性CAR-T细胞[13]。这是一个非常复杂且昂贵的过程，因此，尽管TSA可以作为CAR-T细胞的理想靶标，但临床运用很少[14]。随着基因工程领域的发展，另一种类型的肿瘤抗原——肿瘤相关抗原（TAA）的多项临床试验正在进行中。尽管抗原TAA过表达于肿瘤组织，但其在正常组织中仍有较低的表达水平，因此经常会引起肿瘤外毒性[15]。尽管TSA和TAA是实体CAR-T疗法的首选，但当这些疗法不能满足应用需求时，寻找其他类型的靶标就变得至关重要。

一类替代抗原如成纤维细胞活化蛋白（FAP）和血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2），已经取得很好的研究。这类靶标在肿瘤细胞本身不表达，但在与FAP[16]或VEGFR-2[17]相关的肿瘤脉管系统中高表达，CAR-T细胞可通过识别这类抗原阻碍基质形成或血管生成来破坏肿瘤生长。除上述靶标外，双唾液酸神经节苷脂2（GD2）靶点治疗神经母细胞瘤、HER2靶点治疗多形性胶质母细胞瘤[18]、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶点治疗肝癌以及癌胚抗原（CEA）靶点治疗肠癌的CAR-T细胞疗法也已有相关研究。

开发针对实体瘤的CAR-T细胞疗法的最大挑战是寻找有效表达于肿瘤组织而不表达于健康组织的靶抗原。

4 CAR-T所面临的挑战

尽管CAR-T这项新技术取得了令人瞩目的成果，但由于其严重且常见的不良反应以及与之相关的高昂费用，CAR-T细胞疗法所面临的挑战已成为学术界讨论的热门话题。CAR-T细胞疗法相关的毒性与传统化疗及其他靶向疗法不同，CAR-T细胞治疗最常见的毒性反应是细胞因子释放综合征(CRS)和免疫效应细胞相关的神经毒性综合症（ICANS），其他不良反应包括脱靶效应、过敏反应、肿瘤复发等[19]。

4.1 细胞因子释放综合征

细胞因子释放综合征（CRS），也称为“细胞因子风暴”，是由于细胞疗法清除肿瘤时，激活了大量淋巴细胞导致细胞因子（如IL-6、IL-8、IL- 10、TNF-α和IFN-γ等）升高而引起的一系列炎症症状，主要表现为持续高烧、恶心、肌痛、关节痛，并可演变成毛细血管渗漏、缺氧和低血压，严重时可导致器官衰竭。

IL-6是一种具有抗炎和促炎特性的多效性细胞因子，已被认为是CRS毒性的主要介质[20]。DAVILA 等[21]利用CAR-T治疗16例复发或难治性B细胞CLL，缓解率均为80%以上，在治疗过程他们发现其中出现严重CRS反应的患者多数具有较高的IL-6水平。因此，阻断或结合IL-6受体成为治疗CRS的重要环节。目前，托珠单抗（Tocilizumab）和司托昔单抗（Siltuximab）已成为治疗中重度CRS的首选药物。2017年8月，托珠单抗已被FDA批准用于CAR-T细胞治疗后发生的CRS[22-23]。

4.2 免疫效应细胞相关的神经毒性综合症

神经毒性是CAR-T细胞疗法第二常见的严重不良反应，常发生在CAR-T细胞输注后的第3或第4周[24]，可发展为中毒性脑病，伴有精神错乱、失语、共济失调、谵妄、癫痫发作和脑水肿[25]。这些神经系统副作用的发生机制仍未完全了解，可能与CAR-T细胞进入脑脊液中相关，由此，研究者将CAR-T治疗扩展到用于治疗中枢系统白血病及其他肿瘤性疾病，目前相关研究需要进一步深入。

4.3 脱靶效应

CAR-T细胞在攻击肿瘤时，由于其对应的肿瘤靶抗原也表达于正常组织中，故攻击肿瘤时会同时攻击表达目标抗原的正常细胞，造成脏器损伤，即脱靶效应。Morgan等[26]设计包含CD28、4-1BB和CD3ζ信号的CAR-T治疗一名结肠癌转移患者，注射1010个细胞，15 min后患者表现为呼吸困难且胸部X光显示出现肺部浸润现象，并于5天后死亡。死亡原因被认为是患者肺部上皮细胞低水平表达的ERBB2被CAR-T细胞识别，使得大量CAR-T细胞定位于肺部并攻击肺部细胞所致。因此现阶段寻找肿瘤特异性抗原是CAR-T治疗癌症的关键一步，以实现不同癌症的特异性治疗。

4.4 高耐药率

经过多项研究表明，经CAR-T细胞治疗难治性CD19阳性B细胞恶性肿瘤的患者表现出优异的长期缓解，甚至可治愈。但是，在细胞疗法后达到完全缓解的患者中，1年内复发率高达30-50%，此外，约10-20%的患者在治疗后未达到完全缓解[27-28]。

CAR-T细胞介导的免疫监测在细胞治疗后的持久缓解中起着重要作用[29]。CAR-T细胞持续性的丧失可能是抗原阳性复发的重要决定因素。最近，在CD19表达阴性的B-ALL中，接受CAR-T细胞治疗的小儿和成年应答者均报告有肿瘤细胞[27-30]。基于对细胞疗法耐药性机制的了解，现已开发出新颖的潜在治疗策略，包括双重靶向疗法以及多方位CAR-T细胞疗法。

除了以上几个常见毒副反应，CAR-T治疗需要大量预处理，但仍然不能获得持久的反应。CAR-T细胞通过诱导凋亡来杀伤肿瘤细胞，将CAR-T细胞与凋亡抑制剂阻断剂联合使用，有可能提高其治疗效果[31]。

鉴于CAR-T细胞疗法存在致命的不良反应，且不能达到持久的抗肿瘤反应，因此，直到现在，CAR-T细胞疗法仅对极少数晚期血液恶性肿瘤患者有效，对其他血液肿瘤、实体瘤的临床应用仍面临着极大的挑战。

5 展望

经过近三十年的发展，CAR-T才得以应用于少数晚期血液肿瘤，主要限于小剂量临床试验。对于难治性B细胞恶性肿瘤，其显著的反应令人信服。但是，仍然有很多问题亟待解决。什么时候是使用CAR-T细胞的最佳时机？哪些患者从中受益最大？CAR-T细胞疗法可以替代干细胞移植吗？以上问题，需要进一步通过研究可反映疗效的生物学标记来解答。

除了以上问题外，还需解决耐药性，疾病复发，严重的副作用和持久性等各种问题。CAR-T细胞毒性的管理也处于早期阶段。随着越来越多的可用数据，毒性管理在未来几年肯定会发生重大变化。研究重点包括更好地了解细胞因子和其他炎症蛋白在介导毒性中的作用[32]，可以实时通过检测细胞因子检测某些患者的毒性严重程度并直接干预其免疫抑制。

迄今为止，尽管CAR-T疗法在治疗某些血液系统恶性肿瘤中获得显著进展，但在实体瘤中，尚需克服很多障碍。当然，对于CAR-T细胞，这些仍处于初期，但是如果在以后的临床试验中获得阳性结果，这种革命性的免疫疗法将适用于多种肿瘤。

总之：CAR-T细胞疗法打响了新兴的肿瘤免疫之战。