IMN患者血清磷脂酶A2受体抗体阴性原因分析

周雪，钟清）

(重庆医科大学附属第一医院 肾脏内科，重庆)

0 引言

我国成人膜性肾病（membranous nephropathy，MN）发病率逐年升高，研究表明未经治疗的MN患者中超过50%将在10～20年内进展至终末期肾病，膜性肾病作为第二大原发肾小球疾病将带来严重的医疗负担。Xu[1]等对我国数千例肾穿刺病理资料分析，结果提示膜性肾病在60岁以上人群中占比39.83%，已取代IgA成为最主要的病理类型。我国肾炎病理疾病谱发生改变可能与环境恶化、工业化相关生活方式的改变及医疗卫生条件改善有关[2]。有研究提出膜性肾病发病率的升高可能与长期暴露于PM2.5有关，PM2.5每升高10μg/m³，膜性肾病发病风险升高14%[3]。膜性肾病分为特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）与继发性膜性肾病（secondary membranous nephropathy，SMN），其中前者无明确的继发因素，后者有明确的继发因素，如自身免疫性疾病、病毒感染、肿瘤、药物、代谢等。继发性膜性肾病患者的肾脏受累在原发疾病得到控制后可能得到部分缓解，故两者的鉴别诊断对治疗及预后判断有重大意义。特发性膜性肾病的发病机制尚不明确，目前认为是由于自身抗体与足突上的靶抗原结合形成免疫复合物沉积在上皮细胞下，进而激活补体系统诱发肾小球毛细血管壁损伤，从而产生蛋白尿[4]。2009年Beck[5]等发现在成人足细胞胞膜上存在磷脂酶A2受体（Phospholipase A2 Receptor，PLA2R），且在IMN患者的免疫沉积物中能检测到，首次提出PLA2R为IMN的靶抗原，且在血清中存在特异性的PLA2R抗体。后续不同地区多项针对PLA2R的血清特异性抗体的研究表明，在IMN患者中血清PLA2R抗体阳性率在52%～81.7%，特异度大于90%，在继发性膜性肾病中血清PLA2R抗体阳性率不足20%[5-11]，在其他肾小球疾病及健康人群中几乎未检测到PLA2R抗体[5,7]。部分研究也表明血清PLA2R抗体滴度对疾病活动、病情缓解和复发有预测价值[7,11]。在IMN患者治疗过程中随访发现血清PLA2R抗体滴度变化往往早于蛋白尿[12,13]。

传统意义上将无明确继发因素的膜性肾病定义为特发性膜性肾病，近年来有学者提出将膜性肾病从PLA2R角度分为PLA2R阳性或PLA2R阴性相关肾病，PLA2R对于膜性肾病的诊治有着重要作用，不仅膜性肾病进行了重新分类和定义，还提出了新的疾病监测手段。Andrew S. Bombackd等认为可将血清PLA2R抗体检测用于：（1）对膜性肾病进行无创性的诊断；（2）区分特发性膜性肾病和继发性膜性肾病；（3）指导治疗，决定是否使用激素及免疫抑制剂[14]。但是不同研究中IMN患者血清PLA2R抗体阳性率不同，部分IMN患者检测抗体为阴性，对于抗体阴性的IMN患者，缺乏对疾病诊断与活动性监测有效的血清标志物。以下将讨论IMN患者中出现血清PLA2R抗体阴性可能的各种原因。

1 检测方法灵敏度限制

检测血清PLA2R抗体方法多种，常用的有免疫印迹法（Western blot）、间 接 免 疫 荧 光 法(IIFT)、酶 联 免 疫 吸 附 法（ELISA）。Beck、Qin等 使用Western blot检测PLA2R抗 体[5,6]，阳性率分别为70%，81.7%。以转染细胞作为检测基质的IIFT方法也是血液学筛查PLA2R抗体的一种便捷可靠方法，适用于血清PLA2R抗体的定性与定量分析[9]。Debiec和Ronco用Western blot和IIFT两种方法同时检测42例IMN患者的血清PLA2R抗体，定性检查结果无统计学差异[10]。ELISA方法同样适合于血清PLA2R抗体的定性和半定量检测[15]，在符克英[16]的研究中，60例IMN患者分别通过IIFT、ELISA检测血清PLA2R抗体阳性率为76.3%、73.3%，总符合率95%，结论提示IIFT方法敏感性和特异性略高于ELISA方法，IIFT方法也可将实验样本稀释后做半定量实验，但需要专业设备及人员，ELISA相对来说具有定量检测的优势，对实验室设备条件和人员条件要求更低，且最低检出限可达0.6RU/mL。Li等[17]研究也表示IIFT比ELISA更敏感，这与符克英、Dahnrich、Hofstra及Debiec报道的结果一致[10，11，15，16]。不管哪种检测方法对抗体的检测都需要有一定的滴度，这就限制了抗体的检出。不同的检测方法虽在敏感性及特异性上有差异，但定性检查结果基本一致，故方法的选择对于实验的定性结果影响较小。若实验样本数小，不同的检测方法会对结果造成较大差异。

2 血清PLA2R抗体阴性而肾组织PLA2R抗原阳性

在部分血清PLA2R抗体为阴性的IMN患者中，可以检测到肾小球PLA2R抗原沉积[10]。综合相关既往研究结果，PLA2R肾小球沉积阳性率显著高于血清PLA2R抗体[18]。原因考虑如下：（1）检测方法有限，可能造成对部分患者漏检；（2）处于抗原抗体免疫反应早期：近期针对PLA2R抗原表位与血清抗体的研究显示，血清PLA2R抗体与抗原的结合力较一般抗原抗体结合力高，在疾病早期血清PLA2R抗体主要被富含PLA2R抗原的细胞如足细胞结合，只有血清PLA2R抗体产生的速度超过了抗原抗体结合的速度，血清抗体才能被检测到[19]。该设想也得到了临床证实，有报道在疾病初始阶段患者血清抗体阴性而肾组织PLA2R抗原染色阳性，在随访过程中抗体由阴性转化为阳性，有学者称这一现象为“血清转化”[20]；（3）患者处于疾病免疫学缓解期：血清PLA2R抗体阴性而肾组织PLA2R抗原阳性的患者，除了可能处于疾病的早期外，也有可能是处于疾病的缓解期，包括自发缓解及使用免疫抑制剂后缓解，此时免疫活动己经趋于静止，可以检测到残余的肾小球抗原沉积，但血清PLA2R抗体消失[21]。在Hohxa[7]研究中IMN患者血清PLA2R抗体阳性率为52%，比Beck等研究相比降低20%，原因考虑与部分受试患者在取样前使用免疫抑制剂有关。

诸多研究表明，血清PLA2R抗体滴度与疾病活动的临床表现有关，在自发或治疗诱导的缓解期间下降，在复发期间上升[6，7，11，13]。有研究表明IMN患者的血清PLA2R抗体变化往往快于尿蛋白，所以即使在患者临床症状未缓解时检测血清抗体，也可能是阴性结果。在Debiec[10]报道中称PLA2R抗体、抗原检测阳性的差异性可能是由于血液中抗体在肾小球沉积后的急速清除或者超微结构不可逆的改变导致持续性的蛋白尿造成的。目前抗体与抗原检测阳性不一致的原因并不明确[21]。所以血清PLA2R抗体阴性并不能完全排除PLA2R相关IMN的诊断，因此血清PLA2R抗体阴性的IMN患者应加做肾组织PLA2R抗原染色。

3 存在其他致病抗原及特异性抗体

2014年Tomas首次报道THSD7A是特发性膜性肾病的靶抗原[22]。在不同的研究中，THSD7A的患病率从1%到10%不等，但特异性很强[22-27]。Tomas等[22]发现IMN患者THSD7A抗体阳性率3.1%，全部存在于血清PLA2R抗体阴性IMN患者中。一篇关于THSD7A的荟萃分析指出在2626例IMN患者中，68例THSD7A抗体阳性，阳性率为3%，血清PLA2R抗体阴性的IMN患者中THSD7A抗体阳性率显著提高，为6.5%[28]。在全部受试的2626例IMN患者中有仅3例双抗体阳性患者，其中李佳宁报道了全球首例[25]，Wang jia报道2例[26]。在Wang jia的研究中双抗体阳性患者肾小球染色PLA2R和THSD7A抗原沿着肾小球毛细血管壁呈颗粒状融合，这表明两种抗原均发生特异性的自身免疫反应，参与了免疫复合物的形成和沉积。有学者也认为同时出现PLA2R及THSD7A抗体阳性为个例，应该是独立存在的两种不同抗原[27]。虽然血清PLA2R抗体在IMN患者中阳性率不高，但特异性高达99%，对于血清PLA2R抗体阴性的患者可行血清THSD7A抗体检测，两者联合检测抗体阳性率可达80%[29]。

在THSD7A相关膜性肾病患者中，8例（20%）患者在随访3个月内发展为恶性肿瘤，提示THSD7A相关膜性肾病可能与恶性肿瘤有关[24]。在这[22，25，30]3篇研究中也证实了THSD7A相关膜性肾病与肿瘤有关。对于THSD7A相关膜性患者需仔细筛查恶性肿瘤并密切随访。除PLA2R、THSD7A抗原外，有数个关于膜性肾病的其他致病抗原被报道，分别为锰超氧化物歧化酶（SOD2），α烯醇化酶（αENO），醛糖还原酶（AR），中性内肽酶（NEP）等，但有研究表明上述抗原对IMN诊断作用有限[25]。

4 地域及基因问题

各个地区IMN患者血清PLA2R阳性率也有一定差异。一篇荟萃分析中指出：不同地区研究报告的血清PLA2R阳性率在57～82%之间[31]。日本有报道IMN患者血清PLA2R抗体阳性率较其他亚洲国家低，原因考虑是除PLA2R的其他抗原在日本IMN患者中也起到重要作用[8]。同样韩国IMN患者血清PLA2R抗体的检出率为69%(69/100)[32]，伊朗IMN患者体内血清PLA2R抗体检出率为74% (17/23)[33]。有报道推测IMN患者血清PLA2R抗体阴性原因除了存在其他靶抗原，有可能某些隐藏的抗原表位没有表露。而目前已被证实的是，6号染色体上HLA-DQA1基因的单核苷酸多态性可能是靶抗原PLA2R的自身免疫反应的触发点[34]。不同地区及种族疾病易感基因不同，可能造成IMN患者的血清PLA2R抗体阳性率不同。

5 存在尚未发现的继发因素

文献报道在70%～90%的SMN患者中中血清PLA2R抗体为阴性，有研究提出部分肿瘤患者可能在发现肿瘤前2年就出现副肿瘤综合征[35]，部份SMN在疾病初期潜在的继发因素未被识别，被视为IMN，造成“IMN”患者血清PLA2R抗体阴性的假象。但也有报道在SMN(乙型病毒、丙型肝炎病毒、狼疮性肾炎以及恶性肿瘤的MN)患者中血清PLA2R抗体以及肾组织中均有一定比例的阳性率[36,37]。Ronco等人证明在某些形式的继发性膜性肾病中，血清PLA2R抗体的阳性率在10%～ 30%之间[38]。Li等[17]的研究还发现，SMN患者血清PLA2R抗体阳性率高于30%，高于其他相关研究[5]，分析原因可能是乙肝病毒相关性膜性肾病患者在治疗过程中接受某些抗病毒药物治疗时处于异常免疫状态。甚至考虑有些患者IMN与SMN同时存在，相互作用。

综上所述，尽管PLA2R已被公认为是鉴别IMN与SMN生物学指标，但仍有部分IMN患者血清PLA2R抗体阴性。分析可能的原因为：（1）检测方法灵敏度限制；（2）患者处于疾病初期、自发缓解或免疫抑制剂缓解期；（3）有其他致病抗原及特异性抗体存在；（4）地域及基因问题；（5）存在潜在的继发因素。肾组织PLA2R抗原检测阳性率较血清PLA2R抗体高，建议联合检测。但相对于肾组织PLA2R抗原，血清抗体与疾病活动度及预后的关联更加密切。在PLA2R抗体及抗原均为阴性的患者中，进一步检测THD7A抗体或抗原沉积有其必要性。部分IMN患者数月或数年后被发现继发因素的存在，尤其是老年人出现恶性肿瘤并不少见，故需积极筛查潜在的继发因素。对于血清PLA2R阴性的IMN患者建议进一步诊断流程：检测THSD7A抗体-肾组织PLA2R免疫荧光染色-积极寻找潜在的继发因素-随访血清PLA2R抗体（必要时更换检测方法）。虽然IMN患者血清PLA2R抗体阴性原因尚不完全清楚，但通过对相关因素分析，对此部分患者有了更新及准确的诊疗流程。希望将来对于IMN患者的诊治是在血清学监测的下，是个体化、精细化的诊疗方案。