敲低HOTTIP 抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡的机制研究

岳贤文，刘珊珊，王会东

（1.潍坊呼吸病医院 放射科，山东 潍坊；2.潍坊市人民医院 心内一科，山东 潍坊；3.潍坊市人民医院 乳腺外科，山东 潍坊）

本次研究主要通过对人体非小细胞癌细胞系的H1975以及A549 进行研究，从而了解敲低HOTTIP 对恶性肿瘤细胞的增殖、迁移的抑制效果。待此两种细胞系的细胞性状稳定后，将所有细胞转移至RPMI1640 培养基上进行继续培养，并在培养基中预先加入适量10%胎牛血清与抗菌-抗真菌剂混合溶液。控制整体温度为37 ℃，并调整整体培养环境为5%二氧化碳与95%空气，连续培养，将其作为研究对照组。

我们首先通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRTPCR）对正常人体组织以及肿瘤病灶组织中的HOXA 基因簇末端转录物即是HOTTIP 的相对表达进行详细检测分析，同时为分析了解HOTTIP 对A549 以及H197 癌细胞的影响，通过使用RNA 干扰技术合成用于对HOTTIP 形成干扰表达的si-HOTTIP 以及其阴性对照。使用lipofectamine3000 试剂将si-HOTTIP 以及HOTTIP 转染进入H1975 与A549 细胞中，从而完成对HOTTIP 低表达细胞体的构建。并将两组细胞分别分为si-HOTTIP 组以及si-NC 组。

对所有细胞的转染完成后，对HOTTIP 在RNA 的表达量进行测定，测定方法主要使用qRT-PCR 技术完成对所有组别细胞中HOTTIP 相对表达量的测定，其后根据表达量计算出相应的转染效率。通过细胞计数盒-8（CCK-8）分别评测了“对照组”“si-HOTTIP 组”和“si-NC 组”A549和H1975 细胞的活力。使用异硫氰酸荧光素以及硫化丙啶双重染色法完成对各组细胞的凋亡率检测，并通过蛋白质印迹完成对各组细胞中蛋白Bax、cleaved-Caspase-3 以及cleaved-Caspase-9 蛋白表达情况，此三种蛋白主要负责促进细胞凋亡，通过了解细胞中此类蛋白的表达情况即可了解细胞组的凋亡率情况。同时，了解细胞组中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/AKT）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（AMPK）信号通路中的关键蛋白质，包括总PI3K 蛋白（t-PI3K）、磷酸化PI3K 蛋白（p-PI3K）、总AKT 蛋白（t-AKT）和磷酸化AKT 蛋白（p-AKT）、磷酸化蛋白AMPK（p-AMPK）和总蛋白AMPK（t-AMPK）的表达情况[1]。其后使用ImageLabTM图像处理软件完成两种细胞p/t-PI3K 以及p/t-AMPK 条带量化分析处理。此次研究主要使用β-actin 蛋白作为研究比对中的内部参照，并分别使用Transwell 细胞培养小室以及24 孔Millicell 悬挂式细胞培养小室完成对不同细胞组的细胞处理后迁移、侵袭能力测定，所有研究中测定均在相同条件下至少重复3 次并取平均值，以保证研究测定的准确性与有效性。使用SPSS 24.0 软件完成此次研究中所有数据的统计学分析处理，并将数据结果使用平均值±标准差进行表示，其中P 值使用单因素方差分析法进行计算。

为探明敲除HOTTIP 在NSCLC 患者病理学机制中的影响情况，此次研究将使用对照组与si-HOTTIP 组、si-NC 组中A549 以及H1975 细胞中miR-206 表达情况了解HOTTIP对NSCLC 患者病理学机制的影响以及其与miR-206 的影响关系。同时通过合成抑制miR-206 蛋白表达的相关抑制因子以及阴性对照NC 抑制因子，可将其转染至两种细胞中，形成对应处理组，并进一步了解miR-206 对HOTTIP 的介导功能。此外本次研究使用qRT-PCR 技术将确定所有处理组转染后的转染效率情况，了解此种方法的实际应用价值。

此次研究同时还将利用C C K-8 检测对照组、s i-N C+N Cin 组、si-HOTTIP+NCin 组、si-HOTTIP+miR-206in组中A549 以及H1975 细胞的获利情况。并主要使用通过AnnexinV-FITC/PI 双染色法以及流式细胞检测技术完成对各组细胞凋亡率的检测情况，并使用上述蛋白质免疫印迹法ImageLabTM图像处理软件与完成对细胞各蛋白表达的测定，与带量化分析。

为确定EGFR 与miR-206 的关系，此次研究通过双荧光素酶进行检测试验，测定miR-206mimic、NCmimic、EGFR-wt、突变型-EGFR 以及细胞转染情况，形成“miR-206mimic+EGFR-wt”组、“NCmimic+EGFR-wt”组、“miR-206mimic+EGFR-mut”组和“NCmimic+EGFR-mut”组。通过细胞凋亡检测后可知，A549 以及H1975 细胞中，对照组和si-NC 组凋亡率相类似，且si-HOTTIP 组细胞凋亡率明显较si-NC 组细胞更高，组间差异显著（P＜0.05）。敲低HOTTIP表达使Bax、cleaved-caspase3 和cleaved-caspase9 表达量明显较si-NC 组更高，组间差异显著（P＜0.05）。且si-NC 组与对照组细胞间并未出现显著性差异。

通过对细胞实施迁移与侵袭检测后可知，相较于对照组，转染si-NC 对细胞迁移率无明显影响。相较于si-NC 组，转染si-HOTTIP 可使细胞相对迁移率明显下降。且对照组与si-NC 组细胞间无明显相对侵袭率差异。相对于si-NC组细胞，si-HOTTIP 组细胞相对侵袭率明显更低（P＜0.05）。

通过Westernblot 检测后可知，在A549 细胞中，si-NC 组细胞内p-AKT 蛋白表达量与p/t-PI3K 和p/t-AKT 明显更高，组间差异显著（P＜0.05）。而对照组与si-NC 组细胞间无明显差异（P＞0.05）。同时，对H1975 细胞，对照组与si-NC 组t-PI3K以及t-AKT 蛋白表达量均无明显变化。而对A549 细胞，对照组细胞与si-NC 组细胞中蛋白表达情况以及p/t-AMPK 几乎相同，si-HOTTIP 组细胞p-AMPK 表达与p/t-AMPK 表达明显较si-NC 组细胞更低，组间差异显著（P＜0.05）。

Westernblot 检测EGFR 蛋白的表达显示，对A549 细胞和H1975 细胞而言，“对照组”和“si-NC+NCin”组结果相同；但“si-NC+NCin”处理组EGFR 蛋白表达量明显较干扰HOTTIP 更 高（P＜0.05）；与“si-HOTTIP+NCin”处 理 组相比，“si-HOTTIP+miR-206in”处理组细胞中，EGFR 蛋白表达量将在敲低HOTTIP 沉默miR-206 的表达后明显升高（P＜0.05）。

双荧光素酶报告结果显示，相较于对照组，共转染NCmimic 和EGFR-wt 后，细胞中荧光素酶相对活力无明显变化；同时共转染miR-206mimic 和EGFR-wt 后，细胞中荧光素酶活力明显下降，组间差异均具有显著性（P＜0.05）。此外，无论是共转染NCmimic 和EGFR-mut 亦或是共转染miR-206mimic 和EGFR-mut，相较于对照组，经过检测后发现细胞中所存在的荧光素酶相对活性未出现明显改变。

敲低HOTTIP 对于细胞凋亡具有一定促进作用，主要是通过上调表达miR-206 抑制NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭的方式达到促进目的，其中EGFR 可作为miR-206 的作用靶点[2]。此外此次研究结果显示，HOTTIP、miR-206 和EGFR在NSCLC 细胞系两种细胞，均有较为显著的作用，旨在为其他医学从业人员深入研究提供一定参考，为临床治疗方向提供新的思路。