微重力对MC3T3-E1前成骨细胞增殖、分化影响的研究进展

胡逍然，尹文哲，孙奇峰，李阳杰，吴桐，代显葵

(哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150081)

宇航员在太空飞行中经历的微重力导致人体发生严重生理变化，其中包括头部液体移位、液体和电解质流失、肌肉质量减少、空间晕动病、贫血、免疫反应降低以及骨质流失等，骨质流失是这些问题中最重要的问题之一，其严重程度似乎与飞行持续时间有关。航天飞行期间宇航员每月损失1%～2%的骨量，这种损失很大程度上是由于促进骨形成的成骨细胞标志物的减少引起，导致骨形成明显减少和骨吸收增加的潜在分子机制尚不清楚。研究证明微重力条件下骨形成减少与骨成熟标志物的减少，细胞骨架的改变，凋亡和自噬的增加以及其他相关蛋白及基因的变化有关，这也间接表明了微重力下骨质流失是一个复杂的生理过程。本文对近年来模拟微重力条件下MC3T3-E1前成骨细胞增殖和分化影响的研究进展作一综述，以期为航空航天条件下骨丢失的预防和治疗提供一定的理论基础。

1 微重力对MC3T3-E1前成骨细胞增殖的影响

在微重力诱导的骨丢失过程中，成骨细胞增殖的减少起着重要作用。研究表明，暴露于失重或微重力导致的机械负荷减少使负重骨骼骨质流失明显，而机械负荷的增加促进了造型骨骼中的骨形成[1]。Bucaro等[2]在模拟微重力条件下培养MC3T3-E1前成骨细胞，发现其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、重组Runt相关转录因子2(recombinant runt related transcription factor 2，Runx-2)、骨钙素(osteocalcin，OC)和Ⅰ型胶原的表达降低，细胞凋亡增加。维持在微重力用致凋亡因子十字孢碱处理3 h后发现线粒体处理硫醇氧化还原能力下降，对致凋亡因子较正常重力下更加敏感，其相应生物学改变可能是引起细胞凋亡的原因。抗凋亡蛋白Bcl-2和线粒体功能调节蛋白AKT表达的下降，表明细胞在微重力环境中诱导细胞凋亡。随后的实验将MC3T3-E1细胞移入两种藻酸盐载体胶囊中，培养后发现对致凋亡因子十字孢碱和硝普钠的敏感性无明显变化，提示微重力不会直接导致MC3T3-E1前成骨细胞的凋亡[3]。成骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)是一种具有成骨作用的多肽类生长因子，该生长因子在加快骨折愈合、预防和治疗骨质疏松症等方面具有良好的效果。刘俊丽等[4-5]的研究显示微重力下MC3T3-E1细胞增殖受到抑制，ALP活性及骨桥蛋白(osteopontin，OPN)含量降低，加入10-8mol/L OGP处理后，细胞增殖活性显著提高，ALP活性及OPN含量均得到恢复。在进一步的研究中，将OGP改构物奥金肽(osgentide，OST)作用于MC3T3-E1细胞，研究发现1 nmol/L OST5能显著提高微重力下细胞的增殖活性并且促进DNA合成从而使细胞增殖。周骅等[6]发现微重力下MC3T3-E1细胞AKT(丝/苏氨酸蛋白激酶)磷酸化水平降低，加入SC79(p-AKT激活剂)后能促进细胞增殖，初步证明微重力环境可通过影响AKT蛋白的磷酸化水平从而抑制成骨细胞的增殖。

已经证明有几种miRNA可以调节成骨细胞的增殖，但miRNA是否可以在微重力下调节成骨细胞的凋亡以及大多数miRNA与微重力引起的骨丢失之间的关系仍有待探索[7-8]。Sun等[9]研究发现，微重力使MC3T3-E1前成骨细胞数量明显减少，时间依赖性生长曲线下移，死亡细胞百分比增加，而miR-103表达增加。miR-103过表达促进上述情况，miR-103低表达结果则相反。miR-103类似物或抑制剂与Cav1.2 siRNA共转染，显示miR-103过表达降低了Cav1.2蛋白水平，相反则增加了Cav1.2蛋白水平，Cav1.2 siRNA共转染miR-103模拟物和抑制剂时，miR-103寡核苷酸的功能被完全阻断，结果表明miR-103在微重力条件下主要通过抑制Cav1.2的表达来抑制成骨细胞增殖。Wang等发现微重力下的MC3T3-E1前成骨细胞中miR-139-3p表达明显增加，将miR-139-3p类似物和抑制物共转染，发现类似物组凋亡相关蛋白Bax和裂解半胱氨酸蛋白酶-3显著增高，而Bcl-2蛋白水平显著降低。ELK1是ETS家族的转录因子，并且是促进丝裂原活化蛋白激酶级联反应的丝裂原调节途径的重要组成部分，ELK1调节各种细胞过程，包括细胞增殖和凋亡，并且可以通过miRNA调节[10]。实验结果表明，微重力导致ELK1的基因和蛋白表达水平显著降低，miR-139-3p减弱ELK1蛋白水平而不减弱mRNA表达。通过过表达载体(pEX-ELK1)过表达ELK1和RNA干扰以敲低MC3T3-E1细胞中的ELK1基因，在siRNA-ELK1组中，凋亡的成骨细胞比例显著增加，凋亡相关蛋白Bax和裂解半胱氨酸蛋白酶-3表达水平增加，而Bcl-2在siRNA-ELK1组中下调。首次证明miR-139-3p直接靶向调节ELK1蛋白水平以促进成骨细胞凋亡[11]。

2 微重力对MC3T3-E1前成骨细胞分化的影响

2.1 微重力对MC3T3-E1前成骨细胞细胞骨架的影响 细胞骨架是维持细胞形态和感知重力的关键结构。Hughes等[12]发现失重下可引起MC3T3-E1细胞肌动蛋白细胞骨架的改变，反应-扩散可能影响细胞骨架的聚合，进而影响Gl条件下F-肌动蛋白的组装和G2/M条件下微管的聚合，导致细胞周期停滞。目前，关于微重力环境中细胞骨架的研究，大多数都难以比较不同研究之间的变化。Qian等[13]研究并通过应用分形维数分析结合其他方法，描述和量化了MC3T3-E1前成骨细胞对微重力反应的肌动蛋白细胞骨架变化。微重力环境下MC3T3-E1细胞肌动蛋白束减弱或缺失，F-肌动蛋白的平均荧光强度降低。同时，β-肌动蛋白mRNA表达在培养48 h后明显降低。结果表明肌动蛋白细胞骨架复杂性或随机性随着在微重力条件下MC3T3-E1细胞中应力纤维的显著减少，F-肌动蛋白的平均荧光强度降低和β-肌动蛋白mRNA表达水平的降低而显著降低。Xu等研究表明微重力下微丝的破坏抑制了p-Smad1/5/8的核转位及其转录活性；而Runx2表达及其与p-Smad1/5/8的相互作用在MC3T3-E1细胞中通过BMP2刺激促进，细胞松弛素(cytochalasin B，CB)处理后上述诱导完全减弱。结果表明微丝解聚消除了BMP2诱导的Runx2的表达。证实微重力抑制了R-Smad磷酸化和核转位，肌动蛋白微丝可能参与这种抑制过程。Calponin是一种钙调蛋白和肌动蛋白结合蛋白，也在非肌肉细胞中表达，并已被证明有助于骨骼稳态[14]。实验结果显示模拟微重力不影响总CNN1蛋白水平，但显著降低p-CNN1水平，微丝解聚降低了p-CNN1并增加了CNN1和Smads之间的相互作用。CNN1敲低促进了BMP2诱导的Smad1/5/8的磷酸化及其在细胞核中的积累。CNN1的过表达具有相反作用。CB解聚肌动蛋白微丝至少部分地通过CNN1抑制Smad1/5/8诱导的BMP2的磷酸化和核穿梭。结果表明，肌动蛋白细胞骨架解聚通过阻断CNN1的Smad易位来抑制BMP2-Smad信号传导，这可能有助于微重力诱导的骨形成减少[15]。

2.2 微重力对MC3T3-E1前成骨细胞自噬与矿化的影响 在模拟微重力条件下，MC3T3-E1前成骨细胞自噬体或自噬标记蛋白微管相关蛋白轻链(microtubule-associated protein light chain3，LC3)Ⅱ的表达以时间依赖性方式显著增加，细胞存活率没有出现差异，表明MC3T3-E1细胞中的自噬是通过失重诱导而细胞活力没有任何降低。Bcl-2家族蛋白作为细胞凋亡和自噬的双重调节剂起作用，因此参与抑制和诱导自噬。微重力降低了p-mTOR、p-ERK、p-Akt、Bcl-2、SOD蛋白的水平，升高Bax、tBid、Cat、GRP78/BiP，IRE1α，p-PERK的蛋白水平，细胞自噬增加。褪黑激素是一种从大脑松果体分泌的一种激素，具有抗凋亡作用，可作为抗氧化剂分子，对自噬具有抑制作用[16-18]。褪黑素治疗减少了微重力下MC3T3-E1细胞自噬体或自噬。随后的实验显示，褪黑素治疗后恢复了蛋白激酶(p-mTOR、p-ERK、p-Akt)表达，提高抗自噬蛋白Bcl-2及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平；降低了自噬激活因子(GRP78/BiP，IRE1α，p-PERK)、过氧化氢酶Cat、促凋亡蛋白Bax及凋亡关键通路蛋白tBid。结果表明用褪黑激素治疗通过直接干涉受体介导增加ERK/Akt/mTOR的磷酸化来抑制微重力诱导的自噬[19]。Hu等[20]通过模拟微重力处理前成骨细胞MC3T3-E1细胞，实验结果表明，ALP活性下降，茜素红S染色显示矿化面积显著减少，OC、Col Ⅰa1、DMP1表达明显下调，Runx-2以及p-ERK水平降低。研究结果表明模拟微重力条件下ERK活性和成骨相关基因表达的下调有助于抑制成骨细胞矿化的起始阶段，对矿化起始的抑制为微重力诱导的骨丢失提供了新的见解。

2.3 微重力对MC3T3-E1前成骨细胞基因表达及相关蛋白的影响 近年来关于微重力下骨丢失的研究发现多个基因与蛋白之间相互作用共同改变了成骨细胞的分化。Ontiberos等[21]模拟微重力培养MC3T3-E1细胞24 h后发现，细胞成熟标志物ALP和OC表达显著降低，TATA结合蛋白(TATA-binding protein，TBP)mRNA水平没有变化，而Runx2表达抑制超过50%，AP-1依赖性启动子报告基因的活性被抑制超过50%，结果证明微重力抑制成骨细胞分化可能通过降低Runx2和AP-1活性实现。Satio等[22]研究表明微重力可能影响胶原蛋白的翻译后修饰，特别是通过改变交联形成中涉及的酶活性的胶原蛋白成熟途径从而导致成骨功能的下降。模拟微重力抑制MC3T3-E1细胞中的Cav1.2表达和L-型电压敏感性钙通道(L-type voltage-sensitive calcium channel，LTCC)电流。此外，Cav1.2表达的下调和LTCC的抑制与模拟微重力诱导的miR-103的上调部分相关。在微重力条件下LTCC抑制和MC3T3-E1细胞中miR-103上调的关系首次得到证实[23]。韩标等[24]研究发现，微重力暴露下细胞成骨主要标志基因表达降低，IL-6分泌增多，IkB-α磷酸化水平升高，p65蛋白表达及磷酸化水平升高，导致NF-kB通路异常活化，进而抑制成骨细胞的分化。

Makihira等[25]研究结果显示MC3T3-E1细胞长期暴露(7 d)于微重力条件，抑制Runx2，Osterix，Col-IaI，RANKL和OPG基因的表达。微重力可能通过抑制RANKL依赖性信号通路和降低成骨细胞中RANKL的表达从而导致成骨细胞分化减少。之后Sun的研究发现微重力环境下活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成增加，成骨细胞分化减少。ALP、Runx2、OPG、RANKL减少，NO、iNOS、RANKL/OPG比率及p-ERK1/2的增加，但是在富氢培养基(hydrogen rich medium，HRM)孵育之后上述情况逆转。结果表明模拟微重力能够诱导骨组织中的氧化应激并抑制成骨分化，与HRM孵育有效地消除了暴露于微重力引起的过量ROS[26]。姜黄素是从姜黄的根茎中分离的天然酚类产物。它已被广泛用于东方人群，用于治疗许多疾病。在模拟微重力下孵育姜黄素与MC3T3-E1细胞可抑制ROS形成，降低RANKL/OPG比率，提高ALP活性，增强VDRmRNA水平和上调VDR蛋白表达。用姜黄素治疗可减轻微重力引起的骨质流失，可能通过减轻氧化应激和激活维生素D受体促进成骨分化[27]。抑瘤素M(oncostatin M，OSM)作为gp130细胞因子家族中的一员，研究表明OSM可促进成骨细胞的分化和活化，形成矿物质，抑制硬化蛋白的表达。Goyden等[28]通过旋转细胞培养系统(rotary cell culture system，RCCS)模拟微重力，培养的MC3T3-E1前成骨细胞中IL-6的分泌增加，RANKL水平升高且OPG的表达降低，RANKL/OPG比率增加。经OSM处理后IL-6的分泌增加并抵消了微重力对RANKL/OPG比率的影响。结果表明，OSM的作用可能有助于空间飞行期间骨形成和骨吸收的解偶联。Yang等[29]研究表明微重力暴露增强了MC3T3-E1细胞中IL-6 mRNA的表达和NF-B配体受体激活剂的蛋白质水平，降低了ALP、OPG、OPN mRNA及Runx2 mRNA表达，显著抑制细胞内源性H2S的形成并下调CSE(胱硫醚裂解酶)mRNA表达，但对胱硫醚合成酶(cystatohininesynthetase，CBS)mRNA表达没有显著影响。经过GYY4137(硫化氢水溶性供体)处理后上述情况得到逆转。结果证实在模拟微重力下H2S供体促进成骨细胞分化。

长链非编码RNAODSM是一种成骨细胞分化相关的lncRNA。Wang等的实验证明LncRNA ODSM和miR-139-3p相互作用并相互抑制，过表达LncRNA ODSM显著地增加了成骨基因Runx2、BGLAP、COL1A1、ALP的mRNA及ELK1蛋白水平，而敲低lncRNA ODSM显著地降低这些基因及蛋白的表达。另外，用pEX-ODSM和miR-139-3p类似物或其阴性对照转染MC3T3-E1细胞12 h，然后在模拟微重力环境中培养48 h，蛋白质印迹分析显示，miR-139-3p的过表达部分逆转了lncRNA ODSM诱导的ELK1水平。研究结果表明lncRNA ODSM抑制miR-139-3p表达并增强成骨细胞分化[11]。Hammer等[30]应用磁悬浮模拟微重力环境培养MC3T3-E1细胞1周，通过微阵列方法检测基因在0 g和1 g下的表达，发现许多基因的调节同样受到0 g和1 g的影响，包括1 425个上调基因和101个下调基因；而在0 g下生长的细胞表现出相对于1 g条件上调的2 270个基因及135个下调的基因。然而，该信息并未定义受重力应激源影响的基因的功能。Di等[31]应用超导磁体模拟微重力，选取10种常用的管家基因，设计引物并分离出RNA，进行逆转录和RT-PCR后统计分析，在对照组与微重力组对比下，MC3T3-E1细胞中三个最稳定的基因是18S rRNA、TUB和RPL13A。实验结果表明，许多管家基因并不总是在各种实验条件下表达恒定，确定了在强磁场或微重力环境下稳定表达的适当参考基因，它可以作为迄今为止用于重力生物学和磁性生物学研究常用的管家基因的替代选择。Hu等[32]将MC3T3-E1前成骨细胞在模拟微重力下培养，细胞中Runx2、Osx的基因表达和ALP的蛋白活性显著降低。结果表明，微重力可以抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化过程。使用高通量微阵列分析筛选MC3T3-E1细胞中差异表达的lncRNA和mRNA，观察到1 481个ncRNA的表达水平显著改变，筛选出长度超过200个核苷酸的857个lncRNA，包括168个上调lncRNA和689个下调lncRNA。2 264个mRNA被证明是差异表达的，包括459个上调的mRNA和1 805个下调的mRNA。研究结果表明lncRNAs是研究微重力在成骨细胞功能中的作用和机制的新型而有效的候选者。

3 展 望

作为空间飞行环境中航天员严重的生理变化之一，骨质流失引起越来越多的关注。太空飞行的成本过高，通过地面模拟微重力来研究微重力对骨丢失的影响，这也使得实验结果与现实结果存在一定的偏差。实验证明MC3T3-E1前成骨细胞在模拟微重力下增殖与分化受到了抑制，并且多个因素影响了这一复杂的过程。近年来地面模拟研究取得了一定的进展，但是其具体的机制尚不统一。因此，进一步的实验和对微重力下骨形成影响机制的明确研究可为航空航天条件下骨丢失的预防和治疗提供理论依据。