定量蛋白质组和乙酰基蛋白质组绝经前后卵巢组织的定量差异分析

史松，易金玲，刘雁林

（新疆医科大学第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011）

0 引言

绝经定义为由于静止的原始卵泡池耗尽和卵巢卵泡活性丧失而导致的月经永久终止，通常发生在平均51岁（40-60）岁。尽管这是一个自然过程，但更年期仍会在身体和情感上严重影响女性，这与中年的社会心理问题密切相关.大多数报道的更年期表现是潮热和盗汗。此外，更年期还可能导致骨质流失，乳腺疾病，心血管系统问题，情绪和认知功能障碍，性问题等。围绝经期卵巢癌的风险也升高了，流行病学调查评估了更年期的副作用，而绝经过渡期的生物转化很少评估，因此对更年期缺乏系统的了解[1]。这项研究应用了TMT标记的LCMS / MS，结合抗体亲和纯化的乙酰化肽段，来分析绝经前和绝经后卵巢组织中的整体蛋白质组和乙酰蛋白质组。通过比较蛋白质的表达绝经后和绝经前妇女，我们系统地分析了从绝经前到绝经后的分子水平变化，并计算了乙酰化位点周围序列特征的规律性。

1 人体卵巢组织的收集

符合以下入选标准的患者被认为有资格收集样品。①年龄在45-60岁之间；②在手术前至少六个月内未服用任何类固醇激素药物；③绝经前妇女的卵巢良性囊肿行膀胱切除术或附件切除术或绝经后妇女的附件切除术作良性疾病。所有受试者均未患病，例如癌症或器官衰竭。最后分别从三名月经正常，年龄分别为46、48和51的妇女以及另外三名年龄在52、59和59绝经的妇女中分别采集了2、6和8的新鲜冷冻卵巢样本。

2 蛋白质提取和胰蛋白酶消化

将样品在液氮中均化并转移至试管中。然后，将四份裂解缓冲液（8M尿素，1%蛋白酶抑制剂混合物）添加到样品中，放置30分钟。在PTM实验中，还向裂解缓冲液中添加了抑制剂，例如3μMTSA和50 mM NAM以进行乙酰化。在高强度超声处理机（Scientz）上在冰上超声处理三次后，将样品在冰上完全溶解30分钟。沉淀剩余的细胞碎片，并通过在4°C下于12,000 g离心10分钟来去除。使用ΒCA试剂盒获得所得的上清液用于蛋白质水平测试。

然后在56℃下用5 mM二硫苏糖醇消化蛋白质30分钟，并在室温下避光使用11 mM碘乙酰胺进行15分钟烷基化。然后，将100 mM TEAΒ添加到尿素中在蛋白质溶液中稀释至＜2M。接下来，胰蛋白酶加入溶解在缓冲液中的胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50的过夜消化。在胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:100的条件下进行第二次消化4小时。

2.1 TMT标签。按要求指示，使用Strata X C18 SPE色谱柱（Phenomenex）对消化的肽进行脱盐处理。简而言之，将0.5M TEAΒ和TMT试剂中的肽混合物进一步用乙腈处理，在室温下孵育2小时，脱盐并干燥。

2.2 高效液相色谱（HPLC）分离肽。通过高pH反相HPLC用C18色谱柱（5μm粒径，10 mm内径，250 mm长）分离胰蛋白酶肽。为了洗脱，在60分钟内将8%-32%的乙腈（pH 9.0）梯度洗脱成60个馏分。要生成18个总的蛋白质组，将其合并（最终分数1 = 1、19、37、55，73；最后分数2 = 2，20，38，56，74；最后分数3 = 3，21，39，57，75；………；最终分数18 = 18、36、54、72）。将样品分别分为18和6部分后，将样品通过真空离心干燥。

2.3 乙酰化肽的亲和富集。为了富集乙酰基修饰的肽，将胰蛋白酶肽在NETN缓冲液（100 mM NaCl，1 mM EDTA，50 mM Tris-HCl，0.5%NP-40，pH 8.0）中进行孵育（在乙酰基抗体珠存在下）（批号PTM104，PTM Βio）在4℃过夜。通过用0.1%三氟乙酸处理使结合的肽解离。真空干燥后，按照制造商的指示，使用C18 ZipTips（Millipore）对肽样品进行脱盐，以用于LC-MS/MS[2]。

2.4 LC-MS/MS。用0.1%的甲酸（溶剂A）配制胰蛋白酶肽标本，然后将其上样到自制的反相分析柱（长度为15 cm，ID为75μm）上。梯度在26分钟内从6%增加到23%溶剂Β（0.1%甲酸的98%乙腈溶液），在8分钟内增加23%-35%，并在3分钟内增加到80%，并保持3分钟（流速），400 nL/min）在EASY-nLC 1000 UPLC系统上。

2.5 结果和讨论卵巢中全局和乙酰基蛋白质组的鉴定和定量。我们同时使用3个卵巢绝经前样本和3个卵巢样本，通过TMT标记同时鉴定和定量了全球和乙酰蛋白质组图谱绝经后卵巢样本分别为3个。值得注意的是，根据TMT标记和LC-MS / MS对总蛋白和乙酰基蛋白进行定量通常包括以下步骤。首先，从卵巢蛋白质中回收6组消化的肽并进行TMT标记；其次，将6组标记的肽平均混合。第三，对于全球蛋白质组分析，通过HPLC分离为60个馏分，合并为18个馏分，脱盐后通过高分辨率LC-MS/ MS直接分析。用于乙酰基蛋白质组分析，通过HPLC分离为60个馏分，合并为6个馏分，通过HPLC富集乙酰化肽进行了基于抗体的修饰富集，脱盐和质谱分析。通过应用这种方法，可以同时评估全局蛋白和乙酰化蛋白的表达变化[3]。

TMT标记的LC-MS/MS与HPLC的预分离相结合，可以进行全面的蛋白质组图谱分析，并且覆盖范围广。结合乙酰化肽富集方法，该策略有助于同时评估整体蛋白质组变化程度和乙酰蛋白质表达变化。

对于卵巢中的整体蛋白质组，已鉴定出4210种蛋白质，其中3551种蛋白质一式三份进行定量分析。差异表达蛋白质的数量达到了可量化蛋白质总量的5-10%。比较绝经后组和绝经前组在1.3倍变化阈值和t检验P＜0.05时的蛋白表达水平，共发现151种蛋白上调而65种蛋白下调。

为了验证抗体的特异性，在我们的研究中使用MS/MS数据搜索了一些额外的酰化位点。与3047个乙酰化位点相比，MS/MS原始数据中仅检测到35个琥珀酰化位点和43个丙二酰化位点。因此，我们得出结论，本研究中使用的抗体对琥珀酰化具有高度特异性。

3 围绝经期妇女与绝经后妇女差异蛋白和乙酰化蛋白的功能分析

为了探讨差异表达蛋白的功能注释，根据基因本体论比较了绝经后和绝经前标本的生物学过程，细胞成分和分子功能。通常，最明显不同的生物过程包括细胞，单一生物和代谢过程以及生物调节，这些通常是生命的基础。细胞成分主要集中在细胞，细胞器和细胞外区室。最重要的分子功能包括蛋白质结合和催化活性。上述发现也适用于检测到的差异性乙酰蛋白。此外，我们对检索到的差异蛋白和乙酰基蛋白进行了主要三类以外的富集分析[4]。

4 绝经前和绝经后组织之间差异表达和乙酰化蛋白的途径富集

接下来，我们探索了基于KEGG数据库的差异蛋白揭示的途径富集。选择25条上调和25条下调的途径绝经前后卵巢组织中的151种上调蛋白和65种下调蛋白。绝经后卵巢中最上调的途径是补体和凝血级联，而最下调的是ECM-受体相互作用。对于差异化的乙酰化蛋白质，唯一的上调途径是柠檬酸盐循环，而最下调的途径是单纯疱疹感染，胞吞作用和金黄色葡萄球菌感染。这些发现表明，在绝经后，凝结被激活，同时能量供应增加，以满足卵巢的消耗需求。随着补体途径的增加，卵巢试图增强免疫力，同时变得更容易感染，这表明绝经后卵巢变得越来越弱。

5 蛋白质乙酰化的母题分析

为了检测乙酰化位点周围的氨基酸序列，采用基序分析来探索靠近特定乙酰化位点的氨基酸序列，并进行统计以分析结果。乙酰化位点前景和背景上的氨基酸与整个大小匹配，并计算出基序得分和倍数变化。以这种方式，测定了乙酰化位点附近的氨基酸及其各自的统计显着性[5]。

6 当前研究结果和未来发展方向的意义

更年期是自然过程，但对于50岁以上的女性而言却伴随着复杂的变化。更年期，这被认为是一个转折点，可能在某些女性中发生得更早。根据世界卫生组织（WHO）估计，到2050年，将有10亿妇女年龄在60岁以上，这表明绝经后妇女的人数将超过10亿，这已成为全世界公共卫生关注的问题。绝经前后妇女经常表现出更年期的体征和症状，其中更年期过渡期最常见的是潮热，盗汗，反复疲劳，甚至记忆力减退和轻度抑郁.对于严重症状，激素疗法可用于缓解或治疗。目前，多项调查，荟萃分析和流行病学研究已经探索了与更年期相关的潜在因素及其对老年妇女及其家庭的医疗保健和生活质量的潜在副作用[6]。

7 结论

总之，这是绝经前和绝经后卵巢样品中蛋白质组和修饰蛋白质组的首次系统探索。通过全面的蛋白质组学和乙酰蛋白质组学分析，研究了绝经前和绝经后卵巢组织中蛋白质表达和乙酰化的变化。然后，详细评估了绝经期过渡期分子功能，生物学过程，细胞成分，途径和基序的差异性变化。全球蛋白质或乙酰化蛋白质表达水平的特定变化可能构成卵巢病理的潜在标志，并帮助开发更年期症状的治疗方法并最终改善妇女的医疗保健。