环状RNA在肿瘤中作用的研究进展

张春雷，杨 琦，訾晓渊，孙颖浩

(1．海军军医大学长海医院泌尿外科，上海 200433；2．海军军医大学细胞生物教研室，上海 200433；3．联勤保障部队第九四〇医院泌尿外科，甘肃 兰州 730050)

环状RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一种通过反向剪接机制由线性RNA 前体的5′端和3′端共价相接形成具有特殊环状结构的非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)，成为继长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)和microRNAs(miRNAs)之后，另一大类ncRNAs 家族成员，在许多生物过程中发挥调控作用，如细胞增殖、细胞衰老和细胞凋亡等。早在20世纪70年代，circRNAs首先在RNA病毒中发现，但由于其表达丰度较低，被认为是错误翻译造成的垃圾序列。近年来，随着高通量RNA 测序技术和生物信息学技术的发展，已经发现了数以万计的circRNAs，其功能被逐渐识别，实验证明一些circRNAs的表达水平显著高于同源基因的线性转录本的表达水平[1]。CircRNAs在哺乳动物细胞中具有丰富的表达量和进化上具有较高的保守性，在各种生理和病理过程中对基因表达的调控起着重要作用。CircRNAS 在肿瘤的发生发展过程中可能扮演重要角色，多项报道已经先后证明了circRNAs-miRNAsmRNA信号通路参与了各种恶性肿瘤的发生和发展。为此，本文就circRNAs 的生物学特性、形成机制、功能以及在肿瘤发生发展中作用的最新进展进行综述。

1 circRNAs的生物学特性及形成机制

CircRNAs具有多种生物学特性[2]。首先，circRNAs普遍存在于生物界，通过对转录组测序结果中的反向剪接序列分析得知，circRNAs 广泛表达于原核生物和真核生物中，包括病毒、细菌、真菌、动物等。其次，circRNAs具有高度稳定性，由于它们对RNA 核酸外切酶或RNA 酶R 的抗性，circRNAs 比线性RNA 分子更稳定，这可能导致circRNAs 在较为稳定的细胞中富集，具有较高的表达丰度，如在神经元细胞中高表达。CircRNAs 在物种进化上还具有高度保守性，尤其在哺乳动物的脑组织中的表达。不同物种之间的同源性研究表明，人类和小鼠的circRNAs 中高达20%是直系同源的[3]。另外，circRNAs具有较好的组织特异性且较多的富集于外泌体中。

CircRNAs 可由外显子、内含子、基因间序列、反义链序列、ncRNAs 等形成，分为全外显子型circRNAs、内含子型环状RNA(circular intronic RNAs，ciRNAs)、外显子-内含子型环状 RNA(exon-intron-circRNAs， EIciRNAs) 和 其 他 类 型circRNAs。目前，全外显子型circRNAs 形成机制的研究较多，经典的形成机制是由RNA 的5′端及3′端通过共价结合反向剪接形成，另一个比较常见的机制是RNA 序列通过外显子跳读形式产生一个包含外显子的套索结构，套索内的剪接机制通过移除内含子形成circRNAs。CiRNAs 主要是由于在正常剪接过程中形成的内含子套索未能脱分支化造成的，据报道，在内含子序列内，5′剪接位点附近7 nt GU富集片段和分支点附近11 nt 富含C 的基序片段可以促进ciRNAs 的形成[4]。在circRNAs 环化过程中，多种因素参与该过程的调节[5]。例如，circRNAs形成时内含子长度可能起到关键作用，反向剪接位点侧翼序列往往比那些非环化的剪接位点侧翼序列长，这可能是因为序列较长的内含子间可以形成更多的RNA-RNA 相互作用，促进内嵌外显子的环化。外显子长度也可能是一个因素，单环外显子的长度往往是那些非环化外显子长度的3 倍左右，序列较长的外显子可能在空间上优先选择在剪接位点进行3′-5′方式剪接。此外，基因序列的分布也很重要，易形成环化的RNA侧翼通常包含反向互补碱基序列，比如Alu序列，这样的序列可以形成双链RNA 使得进行剪接的序列相互靠近，促进反向剪接的形成，即使仅有30～40 nt 的反向重复序列也能够起到类似的作用。除了以上因素，RNA 结合蛋白(RNA binding protein，RBP)也可以调节circRNAs 的形成，RBP 如Quaking(QKI)和Muscleblind(MBL/MBNL1)可与反式剪接位点侧翼内含子结合并可能驱动环化的发生。另外，具有较高转录效率的亲本基因生成的circRNAs 也相对较多，说明转录效率也是调节circRNAs形成的因素之一。

2 circRNAs的功能

2.1 miRNAs海绵吸附功能

研究结果表明circRNAs上具有miRNAs的结合位点，通过吸附miRNAs起到miRNAs海绵的作用[6]，目前研究的circRNAs作用机制主要集中在这一功能。CircRNAs 可以结合特定的miRNAs，吸附它们并抑制其功能，这种现象称为竞争性内源RNA 假说。早期发现影响斑马鱼中脑发育的circRNA CiRS-7(也称CDR1as)具有70 多个miR-7 的结合位点，同时还可以结合RNA 诱导沉默复合物Argonaute(AGO)蛋白来调节miRNAs 的功能。CDR1as 也可以结合miR-671，后者可以诱导AGO 引起CDR1as自身裂解，起到释放miR-7的作用。然而，像CDR1as这种包含某一特定miRNA 多个结合位点的circRNAs 并不多，比如circHIPK3 只含有两个miR-124 结合位点，但仍保留了调节这种miRNA 的能力，说明对于circRNAs 来说，具有某一特定miRNA多个结合位点的特性可能不是高效调节miRNAs的先决条件，circRNAs 可能通过同时调节多个具有协同作用的miRNAs而发挥作用，比如circHIPK3含有9个具有生长抑制作用的不同miRNAs的结合位点。

2.2 影响基因的转录及剪接功能

CircRNAs可以调控基因的转录[7]，这些circRNAs主要分布在细胞核中。研究者发现EIciRNAs 能够与RNA 聚合酶II 结合，影响其转录活性。比如EIciEIF3J 能够与核内小核糖体核蛋白U1 及EIF3J 的启动子相互作用，进而强化EIF3J 的转录。CircRNAs也能够影响核酸的剪接，circMBL是由MBL的第2个外显子前体mRNA 环化形成，它的侧翼内含子序列能够与MBL 结合，既可以直接影响MBL 的活性，又可以与经典剪接方式竞争，调节MBL前体mRNA的剪接。

2.3 调节翻译及与蛋白质结合

如果circRNAs 环化序列包含其亲本基因的翻译起始密码子，可能会影响同源基因线性转录本的翻译，比如circHIPK3和circDMD 等可以调节亲本基因对应蛋白质的表达[7]。此外，circRNAs 能够与蛋白质结合，通过抑制蛋白质功能而发挥作用[8]。RNA结合蛋白能够与circRNAs特异序列发生结合，导致与之相互作用的mRNA的相关功能如剪接、核输出和亚细胞定位均会受到影响。例如circ-Foxo3在肿瘤细胞中特异表达并影响细胞周期，它能够结合CDK2 和p21 形成RNA-蛋白复合物，破坏CDK2与细胞周期素A和细胞周期素E之间的相互作用，进而影响细胞周期。Circ-Foxo3 还可以和ID1，E2F1，FAK 以及HIF-1α等蛋白相互作用，抑制这些蛋白发挥功能，促进心肌的衰老。PABPN1 翻译与HuR 相关，其对应的环状RNA circPABPN1与HuR 的相互作用降低了PABPN1转录本的翻译效率，为circRNAs 既可以与蛋白质结合，又可以影响翻译提供有力证据。

2.4 翻译蛋白

随着研究的不断深入，circRNAs 的编码功能逐渐被发现[9]。circRNAs存在m6A修饰，METTL3/METTL14-WTAP蛋白复合物能够对circRNAs 进行m6A 修饰，经过修饰的circRNAs先后募集YTHDF3 和eIF4G2，从而启动蛋白翻译过程。在胶质瘤中，circ-FBXW7可翻译蛋白FBXW7-185aa，这种蛋白与亲本基因编码蛋白发挥协同作用，共同调控c-Myc 的稳定性，抑制恶性胶质瘤的进展。Circ-ZNF609可直接翻译蛋白，这种蛋白与肌肉形成有关。Pan 等[10]一项最新报道证明，结肠癌中circFNDC3B 编码蛋白可以抑制Snail1 表达并抑制EMT 和肿瘤进展。

3 circRNAs与肿瘤的发生发展

3.1 circRNAs与消化系统恶性肿瘤

多项研究结果表明circRNAs 与消化系统的肿瘤进展密切相关，包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、胃癌(gastric cancer，GC)、口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、食道鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)、结直肠癌(colorectal cancer，CRC)、胰腺导管腺癌等。CiRS-7 在HCC 组织中含量较高，通过靶向作用于miR-7来促进CCNE1和PIK3CD表达，增强HCC细胞增殖和侵袭能力[11]。曹雪涛院士团队发现circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135)在HCC 组织中显著下调，通过吸附miR-9 促进p21 表达进而抑制HCC 进展[12]。CircPVT1 在GC 组织中表达量高于癌旁组织，进一步实验表明其可通过吸附miR-125 家族成员以促进细胞增殖[13]。Li 等[14]发现hsa_circ_0000096 在GC 组织中显著下调，其可通过抑制CCND1、CDK6、MM9-2 和MMP-9 表达来抑制GC 细胞的增殖和转移。Zhang 等[15]实验证据表明circLARP4在GC组织中下调并通过降低miR-424 靶基因LATS1表达来促进细胞生长和肿瘤转移。CircRNAs在结直肠癌中的研究较多，Huang等[16]发现在CRC组织中cir-ITCH 表达下调后抑制ITCH表达，激活Wnt/β-catenin途径的促肿瘤作用，cir-ITCH 表达上调后细胞增殖能力降低，在CRC 中通过调节ITCH 表达发挥抗肿瘤作用。另有研究报道，hsa_circ_001569 作为CRC 的细胞增殖和侵袭的正调控因子，通 过miR-145 靶 向 作 用 于E2F5、BAG4和FMNL2[17]，hsa_circ_0020397 通过吸附miR-138 促进TERT 和PD-L1 表达从而调节CRC 细胞生物学功能[18]。一项最新研究表明，circLONP2 通过调节miR-17，在CRC 的转移过程中发挥重要作用[19]。在OSCC 的研究中，Chen 等[20]发现与对照癌旁组织相比，circRNA_100290在癌组织中显著上调，通过吸附miR-29b家族成员而增加CDK6 表达，促进肿瘤进展，表明circRNA_100290 可能是OSCC 治疗中的潜在靶标。在ESCC 的研究中，Li等[21]发现cir-ITCH在肿瘤组织中表达量相对较低，与结直肠癌中的作用机制类似，下调的cir-ITCH 可能通过miR-7、miR-17和miR-214等途径降低ITCH的表达水平，激活Wnt/βcatenin 信号通路，因而cir-ITCH 在ESCC 中起到肿瘤抑制作用。另有研究报道表明，circFOXK2通过作为miR-942海绵和与RBP结合共同促进胰腺导管腺癌的生长和转移[22]。

3.2 circRNAs与肺癌

随着对circRNAs 研究的关注，逐渐发现circRNAs 在肺癌的发展中可能也存在重要作用[23]。Cir-ITCH在肺癌中作为一个抑癌因素，充当miR-7和miR-214的海绵，调节其线性转录本ITCH 表达，cir-ITCH 的下调使Wnt/β-catenin 通路激活，启动肿瘤进展机制。研究结果表明hsa_circ_0000064在肺癌组织中上调并促进细胞增殖和转移。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的研究中，circ_0013958在癌组织中表达上调，通过吸附miR-134 上调致癌基因CCND1，促进肿瘤进展，circ_0013958具有作为早期生物标志物用来检测以及筛查肺癌的潜能。Circ_100876 在NSCLC 组织中显著高表达，其表达水平与淋巴结转移和NSCLC肿瘤分期存在相关性。

3.3 circRNAs与泌尿系恶性肿瘤

越来越多的研究验证了circRNAs 在泌尿系肿瘤的诊断和治疗中的价值。在膀胱癌研究中，Huang 等[24]发现circRNA MYLK/miRNA-29a-3p/DNMT3B/VEGFA/ITGB1 信号通路可能与膀胱癌有关，另一项研究结果表明circHIPK3通过靶向作用于miR-558并调节乙酰肝素酶表达量进而抑制膀胱癌的生长和转移[25]。在肾癌的研究中，Wang 等[26]检测了circRNAs 和肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)之间的关系，发现在雄激素受体表达增加的ccRCC 中，circHIAT1 通过雄激素受体介导的circHIAT1/miR-195-5p/29a-3p/29c-3p/CDC42 信号通路，抑制癌细胞迁移和侵袭。最新研究表明circTLK1 作为miR-136-5p 海绵促进肾细胞癌的增殖及转移[27]。在前列腺癌的研究中，已有研究表明circ-SMARCA5 通过抑制细胞凋亡和调节细胞周期等方式促进疾病进展[28]。另有研究通过对CRISPR 全基因组筛选，证实HNRNPL 作为一种RNA 结合蛋白调控RNA 的可变剪接，包括PCa 特异性的癌基因，也可以通过调控反向剪接方式促进circRNAs 形成，参与PCa发展[29]。

3.4 circRNAs与女性生殖系统恶性肿瘤

乳腺癌和卵巢癌一直是威胁女性健康的重要因素，circRNAs相关研究为指导治疗这两种癌症带来了新的希望。在乳腺癌研究中，研究人员发现circ-ABCB10在癌组织中显著高表达，通过吸附miR-1271 促进肿瘤发生[30]。Liang 等[31]报道circCDYL 在转移性乳腺癌患者肿瘤组织和血清中高表达，进一步研究表明转移性乳腺癌患者血清中circCDYL 的含量与患者预后呈显著负相关，这表明血清circCDYL 含量可以作为乳腺癌患者预后的生物标志物。Zheng 等[32]发现三阴性乳腺癌患者肿瘤组织中circSEPT9 高表达，通过竞争性结合miR-637 激活LIF/STAT3 通路，另外，该circRNA 与临床分期及不良预后有关。卵巢癌方面，Bachmayr-Heyda等[33]证明卵巢癌细胞增殖与circRNAs 的总体表达丰度相关。Ahmed 等[34]通过对3 例IIIC期卵巢癌患者的原发部位、腹膜和淋巴结转移病灶进行了测序分析，结果表明，差异表达的circRNAs 的数量明显多于mRNA。

3.5 circRNAs与血液系统恶性肿瘤

多种恶性血液病是由异常染色体易位编码的融合基因导致的，而许多ncRNAs的表达是通过复杂的染色体重排机制形成的，那么二者之间可能存在一定的联系，染色体重排可直接生成融合circRNAs。许多癌症相关的融合基因可能会产生多种circRNAs如circPR和circM9_1，这些circRNAs具有促进增殖和作为原癌基因的特性。You等[35]通过对RNA-Seq数据分析鉴定了急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性早幼粒细胞白血病患者之间差异表达的circRNAs，这些数据支持融合基因表达的circRNAs 促进血液系统恶性肿瘤进展的观点。除此之外，Li等[36]在115例AML样本中发现了显著下调的circRNA-has_circ_0004277，标准化疗可以恢复该circRNA 及其相应的线性转录本亚型WDR37 的表达，提示has_circ_0004277可能影响化疗反应或疾病进展。

3.6 circRNAs与其他肿瘤

CircRNA 在其他多种肿瘤的发病机制中也起着关键作用。例如，骨肉瘤研究中[37]，有报道表明hsa-circ-0016347 通过靶向作用miR-214 上调caspase-1 的表达促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和转移；circUBAP2 通过miR-143 增强靶基因Bcl-2的表达和功能来促进骨肉瘤的发展；hsa_circ_0001564 的表达水平在骨肉瘤组织中增加并且通过作用于miR-29c-3p促进肿瘤形成；hsa_circ_0009910 通过调控hsa_circ_0009910/miR-449a/IL6R 作用通路来促进骨肉瘤的进展。在其他肿瘤中，hsa_circRNA_100395/miR-141-3p/miR-200a-3p 通路可能参与乳头状甲状腺肿瘤的发展[38]，cZNF292和circ-TTBK2分别通过Wnt/β-catenin 和miR-217/HNF1β/Derlin-1 途径调节神经胶质瘤进展[39]；Yang 等[9]研究结果表明circ-FBXW7I 可编码功能蛋白FBXW7-185aa，在神经胶质瘤中具有潜在的预后意义。

4 问题与展望

随着研究的不断深入，circRNAs 的功能开始受到广泛关注，因其具有miRNAs吸附和蛋白质结合功能，能够影响基因的转录、剪接及转录后调控等作用，说明其在细胞生物功能调控方面具有较深远的研究意义。目前circRNAs 的研究尚有几个方面需要改进，首先，随着研究的不断深入，越来越多的circRNAs 被鉴定出来，然而，与之前的ncRNAs 一样，目前面临的主要问题是命名标准不统一。因此，如何为circRNAs 命名设计一个简单且具有唯一性的方式是亟待解决的问题。另一方面是缺乏对circRNAs 更为深入的了解，目前我们对circRNAs 的了解主要集中在检测层面，事实上，circRNAs 是如何生成的，以及机体是如何去除circRNAs 来调节circRNAs的含量我们还不是很清楚。另外，目前我们关于circRNAs 对肿瘤发生发展的研究越来越多，虽然肿瘤的种类在不断增加，但是机制并未出现创新，绝大多数都停留在miRNAs海绵吸附的功能，事实上，circRNAs的功能不仅于此，它们在肿瘤进展中的机制也绝不会仅仅是这单独的一两方面，除了上述总结的circRNAs功能外，仍有许多作用机制值得我们进一步探索，比如，circRNAs 具有不同的亚细胞定位，像CDR1as 这种circRNA 可以结合或者通过自身降解释放miRNAs，那么它是否能够充当转运载体来调节不同条件下亚细胞结构内的miRNAs 含量，进而调节细胞生物学功能？还有，circRNAs 既可以结合mRNA，又可以结合蛋白质，它是否可以作为中介桥梁，使mRNA或蛋白质相互靠近促进两者之间发生作用，或者作为整体发挥生物学功能，这种复合物的主要成分又是什么？

另外，circRNAs本身表达量并不高，它是如何有效的竞争结合miRNAs或蛋白质的，这些都是需要我们考虑的问题。尽管许多研究已经证明了circRNAs 在疾病治疗中的潜在作用，由于其作用效果不确定，尚无法应用于临床中，虽然许多circRNAs 已被证实和肿瘤存在相关性，但无临床数据可供参考。总之，circRNAs具有其独特的特点，对于研究疾病的发生机制，能否作为诊断的生物标记物，抑或是作为治疗的靶点都有重要的研究价值，我们需要对其加深了解，其重要的功能和机制有待我们去发现。