长链非编码RNA在内皮细胞损伤模型中的表达调控研究

张蕊 耿佳 王雪梅

摘要：目的  研究不同應激条件下的内皮细胞（HUVECs）损伤模型中lncRNAs 的表达变化。方法  将HUVECs分为正常对照组、H2O2干预组、LPS诱导组及ox-LDL干预组，正常对照组细胞常规培养，H2O2干预组采用200 μmol/L 浓度的H2O2孵育12 h，LPS诱导组采用100 ng/ml LPS诱导6 h，ox-LDL干预组使用浓度为50 μg/ml ox-LDL的培养液诱导内皮细胞损伤48 h。建立模型后分别检测心梗相关lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL在脐静脉内皮细胞中的mRNA表达;实时荧光定量法测定HUVECs中lncRNAs的表达，以及炎性因子VCAM-1、MCP-1和抗炎因子eNOS、IL-10、Arginine的mRNA表达;ELISA法检测培养上清液中促炎因子及抗炎因子的表达。结果  与对照组相比，ox-LDL干预组lncRNA H19、MAIT、ANRIL的表达均上调，差异有统计学意义（P<0.05）;炎性因子MCP-1和VCAM-1的mRNA表达水平均上调（P<0.05），eNOS的mRNA表达下调（P<0.05），细胞上清液中的MCP-1、VCAM-1的表达增加（P<0.05）。ox-LDL干预组的HUVECs细胞上清液中的eNOS活性低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  lncRNA H19、MIAT、MALAT1、ANRIL参与调控了内皮细胞的脂质代谢。

关键词：长链非编码RNA;动脉粥样硬化;人脐静脉内皮细胞;氧化型低密度脂蛋白

中图分类号：R541.4                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.22.022

文章编号：1006-1959（2020）22-0071-05

Study on the Expression Regulation of Long Non-coding RNA in Endothelial Cell Injury Model

ZHANG Rui1，GENG Jia1，WANG Xue-mei1，2

（1.Teaching and Research Office of Hygiene，Department of Public Health，Xi'an Medical University，Xi'an 710021，Shaanxi，China;

2.the Key Laboratory of Animal Disease Model Research，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，

Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Abstract：Objective  To study the expression changes of lncRNAs in endothelial cell （HUVECs） injury models under different stress conditions. Methods  HUVECs were divided into normal control group， H2O2 intervention group， LPS induction group and ox-LDL intervention group. Normal control group cells were cultured routinely. The H2O2 intervention group was incubated with 200 μmol/L H2O2 for 12 h， and the LPS induction group was 100 ng/ml LPS was induced for 6 h， and the ox-LDL intervention group used a culture medium with a concentration of 50 μg/ml ox-LDL to induce endothelial cell damage for 48 h. After the model was established， the mRNA expression of myocardial infarction-related lncRNA H19， MAIT， MALAT1， and ANRIL in umbilical vein endothelial cells were detected; real-time fluorescence quantitative method was used to determine the expression of lncRNAs in HUVECs， as well as the inflammatory factors VCAM-1， MCP-1 And anti-inflammatory factors eNOS， IL-10， Arginine mRNA expression; ELISA method to detect the expression of pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors in the culture supernatant. Results  Compared with the control group， the expressions of lncRNA H19， MAIT and ANRIL in the ox-LDL intervention group were all up-regulated，the difference was statistically significant （P<0.05）; the mRNA expression levels of inflammatory factors MCP-1 and VCAM-1 were both up-regulated （P<0.05）， eNOS mRNA expression was down-regulated（P<0.05）， and the expression of MCP-1 and VCAM-1 in the cell supernatant increased（P<0.05）. The eNOS activity in the HUVECs cell supernatant of the ox-LDL intervention group was lower than that of the blank control group，the difference was significant （P<0.05）.Conclusion  lncRNA H19， MIAT， MALAT1， ANRIL participate in the regulation of lipid metabolism of endothelial cells.

Key words：Long non-coding RNA;Atherosclerosis;Human umbilical vein endothelial cells;Oxidized low-density lipoprotein

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是造成众多心脑血管疾病（冠心病、脑梗死、外周血管疾病等）共同的病理基础，是心血管疾病和死亡的重要原因，严重危害人类健康[1]。流行病学调查显示[2]，衰老、吸烟、饮酒、高血压、高血糖、高血脂是动脉粥样硬化发生的关键危险因素。此外，动脉粥样硬化的发病还具有家族易感基因遗传倾向。随着我国居民生活水平大幅度提高，饮食偏向高脂高糖，高能量导致人体代谢环境的整体改变，代谢应激使得代谢性疾病的发生率大幅度增加，动脉粥样硬化也呈上升趨势[3]。探索一种新的有效防治AS的方法和作用靶点、延缓或阻止AS的发生与发展、降低其发病率和死亡率是医学界亟待解决的难题。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。生命活动的调控是一个复杂又精细的网络，分别从不同层面调控着疾病的发生和发展，如蛋白质水平、基因水平、转录水平的调控。LncRNA由于本身特殊和复杂的调控机制，有时可以和蛋白质互作调控功能，有时又通过表观遗传学修饰调控基因的转录，或者直接进行转录后调控[4，5]。LncRNA的表达水平能更好地反映疾病状态，其表达状态可被用于某些疾病的精细分期或分类[6]。大量研究证明，lncRNA H19、MIAT、ANRIL和MALAT1与冠心病、肥胖、糖尿病、心梗密切相关，其有望成为急性心梗新的生物标志物和临床治疗的新靶点[7]。为此，本研究分别应用H2O2、LPS、ox-LDL处理脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），建立动脉粥样硬化相关的内皮损伤细胞模型，检测与动脉粥样硬化相关的lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL在脐静脉内皮细胞中的表达及其不同的诱导应激条件下的表达和调控机制，期望能够为动脉粥样硬化相关慢性疾病的发病机制提供新的实验基础和理论依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料与试剂  细胞培养瓶/培养皿（美国Corning）、HUVECs（中国上海细胞库）、高糖DMEM培养基（美国HyClone）、胎牛血清（美国Gibco）、胰蛋白酶（美国ScienCell）、青霉素/链霉素（美国HyClone）、二甲基亚砜（美国Invitrogen）、H2O2、LPS（美国Sigma）、ox-LDL（中国广州Yiyuan Biotechnologies）、eNOS检测试剂盒（中国武汉cusabio）、MCP-1因子的ELISA试剂盒、VCAM-1因子的ELISA试剂盒（中国武汉博士德生物工程有限公司）、反转录试剂盒（thermo生物公司）、实时荧光定量试剂盒（life公司）、lncRNA和mRNA引物（上海生工）。

1.2实验分组  采用随机对照细胞模型实验。HUVECs培养液为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，并添加青霉素/链霉素100 U/ml。实验中的HUVECs在第3～5代。将融合90%的HUVECs消化后计数，以5×104个/ml的密度接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养，各实验组均设3个复孔。内皮细胞体外损伤模型的建立：①实验分组：第一组为正常对照组，细胞常规培养;第二组H2O2干预组，选用200 μmol/L 浓度的H2O2，孵育12 h;第三组为LPS诱导组，100 ng/ml LPS，诱导6 h;第四组为为ox-LDL干预组，添加ox-LDL到培养液中，使得终浓度为50 μg/ml，诱导内皮细胞损伤48 h。

1.3方法  实时荧光定量法测定HUVECs中 lncRNA和炎性因子，氧化应激指标，脂质代谢相关分子的mRNA表达：实验处理后，收集细胞上清液，将培养皿的细胞层用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗，弃去冲洗液，加入细胞裂解液，提取细胞的总RNA，按照1 μg总量的RNA，逆转录合成cDNA，进行实时荧光光定量检测。2-△△Ct法计算检测相关因子的表达，引物序列见表1。ELISA法检测HUVECs细胞上清液中的促炎因子和抗炎因子：细胞培养48 h后收集上清液，根据说明书测定VCAM-1、MCP-1的浓度，eNOS的活性。

1.4统计学分析  采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。计量资料采用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），方差齐性以Levene's检验，当方差齐时，选用LSD-t检验，当方差不齐时，选用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同损伤模型中lncRNAs分子的表达比较  ox-LDL干预组lncRNA - H19、MAIT、ANRIL的表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;MALAT1表达高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），见图1A。H2O2干预组lncRNA H19的表达低于对照组，差异有统计学意（P<0.05），MAIT和ANRIL表达低于对照组，MALAT1表达高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），见图1B。LPS诱导组lncRNA H19、MAIT、ANRIL的表达均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），MALAT1表达低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），见图1C。

2.2 Ox-LDL诱导损伤模型中HUVECs细胞炎性因子的表达比较  Ox-LDL干预组的炎症因子MCP-1和VCAM-1 mRNA表达均高于对照组，eNOS表达低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;Ox-LDL干预组IL-10和Arginine表达低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

2.3 Ox-LDL诱导损伤模型中HUVECs上清液中的促炎因子表达比较  ox-LDL组细胞上清液中MCP-1、VCAM-1的表达高于对照组，eNOS表达低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。

3讨论

本研究主要检测了氧化应激、炎症和高脂应激三种诱导损伤模型中lncRNAs分子的表达，通过比较lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL的表达，发现ox-LDL诱导的内皮损伤模型中lncRNA H19、MAIT、ANRIL的表达升高，在高脂应激引起动脉粥样硬化等心血管疾病的发生机制中发挥作用，同时伴随着炎症的损伤加剧。

动脉粥样硬化发生的重要始动因素是血管内皮细胞的损伤，是一个长期动态累积的过程。对于AS发病机制的假說主要包括脂质浸润学说（脂源性学说）、炎症学说、氧化应激学说、血小板聚集和血栓形成学说等。脂质浸润学说认为血脂增高会引起脂质渗入到血管壁，转变成脂质斑块沉积。炎症学说认为动脉粥样硬化是一种以慢性炎症反应为特征的炎症性疾病，其病理进程包含炎性巨噬细胞的表型增多，血管壁表层内皮细胞的损伤，炎症因子分泌增加，巨噬细胞吞噬脂质形成坏死核心，平滑肌细胞增殖迁移，最终刺激血管壁纤维增生及斑块形成。氧化应激学说认为，机体的氧化还原是一个动态的平衡过程，当机体受到外界刺激，细胞能量代谢紊乱，能量供应器线粒体发生过度分裂，抑制细胞呼吸链的活性，引起细胞内的活性氧（ROS）生成增加，ATP合成减少，膜电位ΔΨm降低，导致内皮依赖的血管舒张功能下降[8]。常见外源性应激的刺激因子是：脂多糖、炎症介质、自由基、高糖等[9]。本研究模拟动脉粥样硬化三大机制和条件，分别造成氧化应激、炎症、高脂诱导三种模型。第1种是H2O2刺激模拟氧化应激的内皮细胞损伤模型，H2O2能够直接氧化细胞膜上的脂质及蛋白，自由进入细胞内，同细胞内铁离子反应生成活性更强的自由基，导致一系列过氧化反应[10];第2种是LPS刺激模拟经典的炎症损伤模型，LPS内的类脂A和重要群特异性多糖O抗原是引起炎症反应、休克的重要介质[11];第3种是ox-LDL刺激的高脂损伤模型，ox-LDL诱导内皮细胞损伤，分泌炎症因子，单核细胞趋化因子，促进单核细胞浸润进入血管壁，分化成巨噬细胞，进而吞噬脂质，形成泡沫细胞。促进M1型巨噬细胞的表型，降低M2型巨噬细胞的表型，加剧炎症反应 [13]。同时，ox-LDL会促进活性氧的生成，降低线粒体呼吸链的功能，促进细胞凋亡，减弱巨噬细胞的胞葬作用，加快脂质核心的形成[14]。在本次研究中，通过测定lncRNA H19、MAIT、MALAT1、ANRIL的表达，表明在不同病理模型都存在着lncRNA不同的表达谱。即lncRNA 的表达时向与动脉粥样硬化的发生发展有着密切联系，但其相关表达机制相关研究还处于初始阶段。

MCP-1、VCAM-1具有广泛生物学活性，且与内皮细胞炎症损伤呈正相关关系。MCP-1是单核细胞趋化因子，由内皮细胞分泌，通过募集血液中的单核细胞渗透进入血管壁，形成巨噬细胞发挥吞噬作用。VCAM-1能够促进内皮细胞对单核细胞的粘附，使单核细胞牢固粘附在管壁上，在巨噬细胞吞噬脂质的过程中起到关键作用[15]。NO可促进血管的舒张，eNOS活性代表着血管NO合成的速率，eNOS是一种正向的活性调节酶[16]。本次实验结果显示，ox-LDL组细胞上清液中MCP-1、VCAM-1的表达升高，eNOS活性降低，因此可以认为在高脂应激环境下，炎性因子的表达增高，使得心血管相关lncRNA表达，从而加剧动脉粥样硬化的发生和发展。

LncRNA在不同层次调节基因和蛋白的表达机制已经成为当前的研究热点[17]。肺癌转移相关转录本1（MALAT1）位于人染色体11q13，是第一个与肺癌疾病相关联的长链非编码RNA，研究显示，MALAT1参与了压力负荷小鼠的心脏重塑[18]。印记基因lncRNA H19位于人类11号染色体，参与心肌的纤维化，调控心肌肥厚的形成[19]，lncRNA H19的多态性与中国汉族人群冠心病的风险和严重程度相关。有研究表明LncRNA H19通过调控mir-675的表达，间接下调胰岛素样生长因子-1受体，抑制妊娠期胎盘生长，参与糖尿病的病理发展[20]。INK4基因座中反义非编码RNA（ANRIL）是9p染色体上的LNK4基因座的反义lncRNA，其位于冠心病易感区域，粥样斑块中ANRIL的表达能够促进VSMC增殖和动脉粥样斑块形成[21]。心肌梗死相关lncRNA MIAT位于人类22号染色体上，是急性心梗的敏感位点，其高表达与AMI的发生呈正相关。研究报道急性心肌梗死患者外周血的lncRNA基因芯片测定结果，与正常组比较，表达谱有显著性差异，MIAT和MALAT1 与心功能呈负相关。敲低MIAT的表达，减缓了糖尿病导致的视网膜损伤进程。即通过敲除MIAT基因，从而减少糖尿病诱导的促炎因子的释放，达到减轻血管渗漏和视网膜血管的损伤的目的[22]。

总之，目前对于lncRNA的研究还处于初级阶段，对于其具体导致疾病发生发展尚不明确，且明确功能的相关lncRNA数目并不多。随着研究技术的提高，对于RNA水平的研究也越来越先进，以后会发现更多相关并具有一定功能的lncRNA，更深入研究其相关机制，为动脉粥样硬化相关患者的防治提供新的诊断依据和诊疗措施。

参考文献：

[1]胡盛寿，高润霖，刘力生，等.《中国心血管病报告2018》概要[J].中国循环杂志，2019，34（3）：209-220.

[2]Oliveira Helena CF，Vercesi Anibal E.Mitochondrial bioenergetics and redox dysfunctions in hypercholesterolemia and atherosclerosis[J].Mol Aspects Med，2020（71）：100840.

[3]Valenzuela Carina A，Baker Ella J，Miles Elizabeth A，et al.Eighteen carbon trans fatty acids and inflammation in the context of atherosclerosis[J].Prog Lipid Res，2019（76）：101009.

[4]Sallam T，Sandhu J，Tontonoz P.Long Noncoding RNA Discovery in Cardiovascular Disease：Decoding Form to Function[J].Circ Res，2018（122）：155-166.

[5]Lucas T，Bonauer A，Dimmeler S.RNA Therapeutics in Cardiovascular Disease[J].Circ Res，2018（123）：205-220.

[6]Khyzha N，Alizada A，Wilson MD，et al.Epigenetics of Atherosclerosis： Emerging Mechanisms and Methods[J].Trends Mol Med，2017（23）：332-347.

[7]Fasolo F，Di GK，Maegdefessel L，et al.Non-coding RNAs in cardiovascular cell biology and atherosclerosis[J].Cardiovasc Res，2019（115）：1732-1756.

[8]Wang H，Zhang K，Ruan Z，et al.Probucol enhances the therapeutic efficiency of mesenchymal stem cells in the treatment of erectile dysfunction in diabetic rats by prolonging their survival time via Nrf2 pathway[J].Stem Cell Res Ther，2020（11）：302.

[9]Basak M，Mahata T，Chakraborti S，et al.Malabaricone C Attenuates Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drug-Induced Gastric Ulceration by Decreasing Oxidative/Nitrative Stress and Inflammation and Promoting Angiogenic Autohealing[J].Antioxid. Redox Signal，2020（32）：766-784.

[10]Hahad O，Prochaska J H，Daiber A，et al.Environmental Noise-Induced Effects on Stress Hormones，Oxidative Stress，and Vascular Dysfunction：Key Factors in the Relationship between Cerebrocardiovascular and Psychological Disorders[J].Oxid Med Cell Longev，2019（2019）：4623109.

[11]Zadeh JK，Zhutdieva MB，Laspas P，et al.Apolipoprotein E Deficiency Causes Endothelial Dysfunction in the Mouse Retina[J].Oxid Med Cell Longev，2019（2019）：5181429.

[12]Lu S，Luo Y，Zhou P，et al.Ginsenoside compound K protects human umbilical vein endothelial cells against oxidized low-density lipoprotein-induced injury via inhibition of nuclear factor-κB，p38，and JNK MAPK pathways[J].J Ginseng Res，2019（43）：95-104.

[13]Tsai KL，Hung CH，Chan SH，et al.Chlorogenic Acid Protects Against ox-LDL-Induced Oxidative Damage and Mitochondrial Dysfunction by Modulating SIRT1 in Endothelial Cells[J].Mol Nutr Food Res，2018（62）：e1700928.

[14]Takahashi Y，Watanabe R，Sato Y，et al.Novel phytopeptide osmotin mimics preventive effects of adiponectin on vascular inflammation and atherosclerosis[J].Metab Clin Exp，2018（83）：128-138.

[15]Zhang Y，Cao X，Zhu W，et al.Resveratrol Enhances Autophagic Flux and Promotes Ox-LDL Degradation in HUVECs via Upregulation of SIRT1[J].Oxid Med Cell Longev，2016（2016）：7589813.

[16]Wang J，Wang WN，Xu SB，et al.MicroRNA‐214‐3p：A link between autophagy and endothelial cell dysfunction in atherosclerosis[J].Acta Physiologica，2018，222（3）.

[17]Zhang M，Gu H，Chen J，et al.Involvement of long noncoding RNA MALAT1 in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy[J].Int J Cardiol，2016（202）：753-755.

[18]Tao H，Cao W，Yang JJ，et al.Long noncoding RNA H19 controls DUSP5/ERK1/2 axis in cardiac fibroblast proliferation and fibrosis[J].Cardiovasc Pathol，2016，25（5）：381-389.

[19]Liu L，An X，Li Z，et al.The H19 long noncoding RNA is a novel negative regulator of cardiomyocyte hypertrophy[J].Cardiovasc Res，2016，111（1）：56-65.

[20]Murray R，Bryant J，Titcombe P，et al.DNA methylation at birth within the promoter of ANRIL predicts markers of cardiovascular risk at 9 years[J].Clin Epigenetics，2016（8）：90.

[21]Qu X，Du Y，Shu Y，et al.MIAT Isa Pro-fibrotic Long Non-coding RNA Governing Cardiac Fibrosis in Post-infarct Myocardium[J].Sci Rep，2017（7）：42657.

[22]Sun GQ，Li YB，Ji ZY.Up-regulation of MIAT aggravates the atherosclerotic damage in atherosclerosis mice through the activation of PI3K/Akt signaling pathway[J].Drug Deliv，2019（26）：641-649.

收稿日期：2020-06-30;修回日期：2020-08-01

編辑/成森

基金项目：1.国家自然科学基金地区基金项目（编号：81760083）;2.西安医学院大学生创新创业训练计划项目（编号：省级;校级<121519049>）;3.陕西省教育厅重点实验室项目（编号：20JS137）

作者简介：张蕊（1997.12-），女，陕西洛川县人，本科

通迅作者：王雪梅（1983.2-），女，新疆库尔勒人，博士，副教授，主要从事心血管疾病的基础和临床研究