产阿魏酸酯酶丝状真菌筛选及发酵条件优化

李松，徐朝旭，林陈莹，魏胜华，李艳宾

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖，241000)

阿魏酸酯酶又称肉桂酸酯酶，属于羧酸水解酶的一个亚类[1]，主要应用于作为膳食纤维补充剂阿魏酸的分离制备及酚酸化合物的合成[2-4]，在造纸工业中可与漆酶、纤维素酶等通过协同作用去除木质素并提高纤维素降解效率[5]，亦可应用于饲料的预处理以提高反刍动物对饲料营养的吸收[6]。此外，阿魏酸酯酶可以加速木质纤维素的降解，在生物质利用和燃料乙醇的生产中亦具有重要的应用前景。

阿魏酸酯酶首次于1987年在蓝色链霉菌属(Streptomycesolivochromogenes)中发现[7]，FAULDS等[8]在1991年第一次从该菌中将阿魏酸酯酶分离纯化，之后诸多阿魏酸酯酶在不同的微生物中被发现。目前,已从微生物中发现了40多种阿魏酸酯酶，其中曲霉属约占产阿魏酸酯酶微生物的1/3[9-12]。真菌中主要有黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、黄柄曲霉、绳状青霉、泡盛曲霉、塔宾曲霉和里氏木霉等[13]，细菌中主要有溶纤维丁酸弧菌、纤维弧菌、热纤维梭菌、嗜酸乳酸杆菌和光假单胞菌等[14]。虽然阿魏酸酯酶存在范围较广，且真菌、细菌和植物中的阿魏酸酯酶均分别得到了深入研究[15-19]，但是目前已报道的微生物发酵产阿魏酸酯酶水平普遍不高，尚不能满足工业化生产需求。因此通过自然选育获得阿魏酸酯酶高产菌株依然是目前解决阿魏酸酯酶工业发酵产酶水平过低的重要方法之一[9,20-21]。本研究以筛选阿魏酸酯酶高产菌株为目的，从多种自然样本中筛选得到8株产阿魏酸酯酶丝状真菌，并对其中1株产阿魏酸酯酶能力最高的菌株进行了分子生物学鉴定和发酵条件优化，以期为阿魏酸酯酶产生菌种的选育和工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、木糖、可溶性淀粉，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲醇，SIGMA公司；麸皮、豆渣、黄豆饼粉、玉米粉，市场；稻草秸秆，农村；阿魏酸、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯，上海源叶生物科技有限公司；T-载体、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司产品；5.8S ITS-rDNA PCR扩增通用引物(ITS1和ITS4)，上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 自然样本

自然土壤样本分别采自安徽天堂寨风景区和安徽芜湖神山公园。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15，自然pH。115 ℃灭菌20 min，在冷却至55 ℃左右时添加卡那霉素至终质量浓度为50 μg/mL，摇匀后倒平板。

初筛培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15，Triton X-100 0.2，自然pH。115 ℃灭菌20 min，在冷却至55 ℃时按每100 mL培养基加入1.5 mL体积分数为 10%阿魏酸乙酯(二甲基亚砜)溶液，并添加卡那霉素至终质量浓度为50 μg/mL，摇匀后倒平板。

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白10，K2HPO41，pH 6.0，115 ℃灭菌20 min。

发酵培养基(g/L)：FeSO4·7H2O 0.01，NaNO32，NH4Cl 3，豆饼粉5，蔗糖10，玉米浆干粉5，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，麦麸20，pH 6.0，于115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

PCR仪(TC312)，美国TECH公司；组合式恒温摇床(HYL-C)，太仓市强乐实验设备有限公司；恒温金属浴(HB-100)，杭州博日科技有限公司；pH计(FE20)，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；离心机(1-14)，德国SIGMA公司；高效液相色谱仪(P230)，大连依利特分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种筛选与鉴定

(1)菌种初筛：将不同土样使用无菌水进行10倍稀释后涂布于PDA培养基平板，30 ℃恒温培养4 d后，挑取生长出来的真菌菌丝接种至初筛培养基，继续于30 ℃培养4 d后观察其是否产生透明圈，选择产生透明圈的真菌进行摇瓶发酵并测定阿魏酸酯酶酶活力。

(2)菌种复筛：将初筛菌株在PDA平板中培养4 d后，使用10 mL无菌水洗下孢子后，接种1 mL孢子悬液至种子培养基30 mL/250 mL，于30 ℃、200 r/min条件下培养48 h后按体积分数为10%比例接入发酵培养基50 mL/250 mL，并于30 ℃、200 r/min条件下发酵6 d后测定阿魏酸酯酶酶活力。选取发酵酶活力高的菌株进行后续实验。

(3)筛选菌株分子生物学鉴定：真菌染色体DNA提取、质粒DNA小量制备及DNA连接、转化等分子操作参照文献[22]进行。以染色体DNA为模板，分别以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为上下游引物，在54 ℃下进行扩增，得到PCR产物经纯化后连接T-载体，提取重组质粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因序列测定。所得ITS-rDNA序列的比对及菌株系统发育树的构建参见文献[23]进行。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活力测定

阿魏酸酯酶酶活力测定：参考ZHANG等[24]方法进行酶催化反应，反应中释放的阿魏酸含量采用高效液相色谱法测定[25]。色谱条件为色谱柱：ODS-C18；柱温：40 ℃；流动相：V(体积分数1%乙酸)∶V(甲醇)=72∶28；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。酶活力定义：在该反应条件下，1 min降解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需的阿魏酸酯酶酶量定义为1个酶活力单位(U)。

1.3.3 单因素优化

(1)单因素实验：采用1.3.1小节所述菌种复筛发酵条件，分别将培养温度设置为24～34 ℃以研究不同温度对发酵产酶的影响；分别将发酵液初始pH调节至4～8，以研究pH对发酵产酶的影响；分别将碳源(10 g/L)调整为葡萄糖、糊精、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和木糖，以研究不同碳源对菌株产酶的影响；分别将氮源调整为NaNO3、(NH4)2SO4、尿素、NH4Cl、豆饼粉、玉米浆干粉和豆渣至最终含氮量为2 g/L，以研究不同氮源对菌株产酶的影响；分别将诱导物(10 g/L)调整为啤酒糟、秸秆、玉米粉、玉米浆和麸皮，以研究不同物质对菌株诱导产酶的影响。

(2)单因素爬坡实验：将最适碳源的质量浓度调至10～40 g/L，最适氮源的质量浓度调至20～120 g/L，最适诱导物的质量浓度调至10～40 g/L，以研究碳源、氮源和诱导物质量浓度对菌株产酶的影响。

1.3.4 中心组合设计实验

根据单因素爬坡实验结果，对蔗糖、豆渣和啤酒糟3个因素进行Box-Benhnken实验，每个因素取3个水平，响应值为阿魏酸酯酶酶活力(U/L)，实验设计见表1。

表1 响应面实验设计 单位：g/L

2 结果与分析

2.1 菌种筛选与鉴定

2.1.1 菌种筛选

从不同土壤样本中共筛得到43株丝状真菌，其中有8株可在初筛培养基中培养后产生透明圈，如图1所示。摇瓶发酵复筛结果表明，菌株W2发酵活力相对较高，如图2所示，因此在后续实验中采用W2作为出发菌株进行研究。

图1 平板初筛结果Fig.1 Primary screening results

图2 筛选菌株发酵产阿魏酸酯酶酶活力比较Fig.2 Activity of feruloyl esterase produced by isolated strains

2.1.2 菌种鉴定

以菌株W2染色体DNA为模板进行PCR扩增，所得5.8S ITS-rDNA序列经测序、同源比对和系统发育树分析表明，菌株W2与曲霉属(Aspergillussp.)同源性较高，如图3所示。在鉴定到种的菌株中与1株土曲霉菌株(AspergillusterreusX3)同源性最高(GenBank登录号：KU573776.1；同源性：100%)，因此，基于系统发育树分析和同源性比对分析结果，将W2鉴定为土曲霉。

图3 W2菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of W2 strain

2.2 单因素实验

2.2.1 发酵温度和pH对产酶的影响

由图4-a可知，当培养温度为26 ℃时土曲霉W2发酵产阿魏酸酯酶酶活力最高，且随着温度上升，发酵酶活力急剧下降。由图4-b可知，土曲霉W2的最适产酶pH为5.0，且随着pH升高，酶活力逐渐降低。

图4 温度和pH对土曲霉W2发酵产阿魏酸酯酶的影响Fig.4 Effect of temperature and pH on the activity of feruloyl esterase produced by A.terreus W2

2.2.2 碳源、氮源和诱导物对产酶的影响

如图5-a所示，不同碳源对土曲霉W2产酶的影响不同，添加蔗糖时产酶效果最好，其次为木糖，而使用乳糖时产酶效果最差。如图5-b所示，天然的复合氮源产酶效果较好，如豆渣和玉米浆干粉，而铵盐对发酵产酶效果最差，如NH4Cl和(NH4)2SO4。阿魏酸酯酶是一种诱导酶，因此在发酵过程中通常需要添加诱导物以提高发酵产酶水平，如图5-c所示，使用啤酒糟时所得阿魏酸酯酶活力最高，其次为麸皮和秸秆，而采用玉米粉时诱导产酶效果较差。

a-碳源对发酵产酶的影响；b-氮源对发酵产酶的影响；c-诱导物对发酵产酶的影响图5 碳源、氮源及诱导物对土曲霉W2产阿魏酸酯酶的影响Fig.5 Effect of carbon source， nitrogen source and inducer on the activity feruloyl esterase produced by A.terreus W2

2.3 爬坡实验

分别选择单因素实验中产酶效果最好的碳源、氮源和诱导物进行爬坡实验，如图6所示，蔗糖、豆渣和啤酒糟的质量浓度分别采用30、80和25 g/L时所获得的发酵酶活力最高。

2.4 响应面设计优化

图6 蔗糖、豆渣及啤酒糟对土曲霉产阿魏酸酯酶的影响Fig.6 Effect of sucrose, bean dregs and brewer’s grains on the activity level of feruloyl esterase produced by A.terreus W2

表2 响应面实验结果分析Table 2 Analysis of response surface experiment results

表3 回归模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance

图7 不同变量交互作用对产酶的影响曲面图Fig.7 Surface plot for the effect of different variables interaction on the activity of feruloyl esterase produced by A. terreus W2

3 结论与讨论

目前研究报道的阿魏酸酯酶产酶水平较高的丝状真菌多为曲霉属，本研究从大量丝状真菌中筛选得到1株阿魏酸酯酶高产菌株，经鉴定为土曲霉，同属于曲霉属。对筛选菌株土曲霉W2进行了单因素试验和响应面设计优化，结果表明使用啤酒糟作为诱导物时产酶效果最好，碳、氮源分别使用蔗糖和豆渣时产酶效果最好，最适产酶温度和pH分别为26 ℃和5.0。最终优化后的培养基组成(g/L)：葡糖糖30，啤酒糟24.5，豆渣81，FeSO4·7H2O 0.01，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41，pH 5.0。使用优化培养基发酵6 d后阿魏酸酯酶酶活力达到205 U/L，约为优化前产酶水平的3倍。目前阿魏酸酯酶表达量较高的多为异源表达，如李兵等[26]将密码子优化后的黑曲霉阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母中进行表达，获得最大表达量为(39.9±0.1)U/mL，远远高于本研究利用原始菌株所得表达水平，表明本研究所得结果距离工业化应用尚有很大差距。综上所述，本研究为阿魏酸酯酶高产菌株的选育和基因工程菌的构建提供了1株良好出发菌株，发酵优化结果为该菌株的后续放大发酵和应用研究奠定了基础。同时，菌种诱变选育和阿魏酸酯酶基因的异源表达将是本研究后期的主要方向。