石油烃高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化

段潍超，杨泽群，刘其友

(1.青岛欧赛斯环境与安全技术有限责任公司，山东 青岛 266555； 2.中国石油大学(华东)，山东 青岛 266555)

石油是目前人类使用最为广泛的能源之一，但在开采、储运、炼制及加工过程中，石油因事故、泄漏或排污等不可避免的会进入水体和土壤中，从而污染生态环境[1-3]。相较于物理法和化学法，微生物法可将烃类物质矿化成H2O、CO2及其它无毒物质，且由于投资少和能耗低等优势，已成为石油污染修复技术的发展趋势[4]。自然界中广泛存在着许多能够降解石油的微生物[5]。谢丹平等[6]分离得到了可降解C12～C22直链烷烃的芽孢杆菌属菌株和邻单胞菌属菌株；李宝明等[7]成功筛选到1株高效降解芳香烃的苍白杆菌属菌株和2株高效降解直链烷烃的红球菌属菌株；Roy等[8]则分离到5株对阿拉伯混合原油降解率达47%～78%的石油降解菌。随着筛选技术的发展，石油烃高效降解菌会不断被筛选出，但在大多数情况下，单一菌株对石油烃的降解能力仍然有限，若通过构建复配菌群、利用微生物间的协同作用，可极大提高微生物降解石油烃的能力。谢丹平[9]通过复配实验确定了4种石油烃高效降解菌株的最优菌液接种量；张秀霞等[10]研究了复配微生物降解石油烃的最优pH值和接种量；马强[11]研究了复配微生物降解石油烃的最优pH值和温度。

作者基于原油组成选取模式物，从实验室保存的石油烃降解菌株中筛选各模式物的高效降解菌株，并对高效降解菌株的复配进行优化，通过正交实验确定复配菌群的最优降解条件。

1 实验

1.1 菌株与仪器

菌株S1、S2、S3、S4、S5和S6，实验室冷冻保存。

BCM-1000型生物净化工作台，净化设备有限公司；LDZM型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HZQ-QX型全温振荡器、HZQ-X100型振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；GILSON型移液枪，上海华运分析仪器有限公司；Scout Pro型分析天平，奥豪斯国际贸易有限公司；SPX-250B型生化培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；UV-2100型紫外分光光度计，上海昂拉仪器有限公司；KDN-08C型消化炉、ATN-300型全自动凯氏定氮仪，上海洪纪仪器设备有限公司；HH-S6型数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司。

1.2 菌株活化和筛选

菌株活化：在250 mL锥形瓶中，配制100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3 g或5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL，NaCl 5 g，pH值7.0～7.2)，经立式压力蒸汽灭菌器灭菌，冷却至室温；接种2 mL原始菌液至培养基中，置于恒温振荡器，30 ℃、160 r·min-1持续振荡48 h。

菌株筛选：在250 mL锥形瓶中，配制100 mL无机盐培养基[(NH4)2SO41.0 g，K2HPO41.0 g，CaCl20.02 g，NaCl 10 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeCl3痕量，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0]，经立式压力蒸汽灭菌器灭菌，冷却至室温后置于生物净化工作台上，分别加入一定量的甲苯(1 mL)、菲(0.2 g)、石蜡(3 g)和原油(0.1 g)；无菌操作取出已活化菌株S1、S2、S3、S4、S5和S6，各接种2 mL菌液至培养基中，置于恒温振荡器，30 ℃、160 r·min-1持续振荡5 d。

1.3 降解率的测定

将模式物甲苯、菲和原油分别溶于一定量的石油醚中，配成标准储备液；分别取一系列不同量的标准储备液，用石油醚定容，得到不同梯度浓度的模式物溶液；用紫外分光光度计测定溶液吸光度(甲苯、菲和原油的最大吸收波长分别为242 nm、211 nm和225 nm)，绘制标准曲线；依据标准曲线方程(表1)进行浓度标定，分别计算甲苯、菲和原油的降解率。

表1 甲苯、菲和原油的标准曲线方程

模式物石蜡的质量标定采用称重法：将降解后含固体石蜡的摇瓶从恒温振荡器中取出，将培养液过滤后风干，称重并记录剩余石蜡质量，按下式计算石蜡降解率(D，%)：

式中：M为降解前石蜡质量，g；M0为降解后石蜡质量，g。

2 结果与讨论

2.1 石油烃高效降解菌株的筛选

2.1.1 单一菌株对甲苯、菲、石蜡的降解率

菌株S1～S6对模式物甲苯、菲和石蜡的降解率如图1所示。

由图1可知，对于模式物甲苯，菌株S2和S5的降解率最高，分别达到了44.44%和39.23%，可参与后期菌株复配；对于模式物菲，菌株S1和S6的降解率最高，分别达到了41.80%和39.68%，可参与后期菌株复配；对于模式物石蜡，菌株S1～S6的降解率均不超过5%，其中S4对石蜡的降解率最高(4.41%)，可参与后期菌株复配。

图1 菌株S1～S6对模式物甲苯、菲和石蜡的降解率Fig.1 Degradation rate of toluene,phenanthrene,and paraffin wax by strains S1-S6

2.1.2 单一菌株对原油的降解率

菌株S1～S6对原油的降解率如图2所示。

图2 菌株S1～S6对原油的降解率Fig.2 Degradation rate of crude oil by strains S1-S6

由图2可知，菌株S1～S6对原油的降解率均不超过20%，分别为18.50%、12.44%、12.66%、10.55%、12.58%、10.50%。除菌株S1略高外，菌株S2～S6对原油的降解率相差不大。

2.2 石油烃高效降解菌株的复配

基于单一菌株对模式物的降解率，选择菌株S1、S2、S4、S5、S6经不同方式组合得到石油烃高效降解菌株复配菌群A、B、C、D(表2)。将4种复配菌群分别接种至含原油的无机盐培养基中，5 d后，测定4种复配菌群对原油的降解率，结果如图3所示。

由图3可知，复配菌群A、B、C、D对原油的降解率分别为28.74%、21.71%、22.47%、24.26%，明显高于单一菌株对原油的降解率。其中，复配菌群A(S1+S2+S4)对原油的降解率最高，这是因为3种单一菌株S1、S2、S4分别对多环芳烃、单环芳烃、长链烷烃具有较好的降解效果，复配后，通过协同作用可以获得更高的原油降解率。因此，选取复配菌群A 进行后续的降解条件优化研究。

表2 4种复配菌群的组成

图3 4种复配菌群对原油的降解率Fig.3 Degradation rate of crude oil by four compound bacteria

2.3 复配菌群A对原油的降解条件优化

选择pH值、底物浓度、氮磷比、接种量和温度为考察因素，以原油降解率为指标，采用5因素5水平正交实验优化复配菌群A对原油的降解条件，结果见表3。

由表3可知，在25组实验中，复配菌群A对原油的降解率最高可达37.52%(12#实验)，相应的降解条件为：pH值7、底物浓度0.4 g·L-1、氮磷比7∶1、接种量1 mL、温度30 ℃；5种因素对原油降解率的影响大小为：pH值>温度>底物浓度>接种量>氮磷比，其中pH值对原油降解率的影响最大，温度次之，氮磷比影响最小，这可能是由于复配菌群A内的原油分解酶对pH值较为敏感所致。

3 结论

对实验室保存的6株石油烃降解菌S1～S6进行活化，然后以甲苯、菲、石蜡为模式物，考察单一菌株对模式物的降解效果，发现对单环芳烃(甲苯)降解效果最好的是S2和S5，对多环芳烃(菲)降解效果最好的是S1和S6，对长链烷烃(石蜡)降解效果最好的是S4。将S1、S2、S4复配得到的复配菌群对原油的降解效果最好，其最优降解条件为：pH值7、底物浓度0.4 g·L-1、氮磷比7∶1、接种量1 mL、温度30 ℃，各因素对原油降解率的影响大小为：pH值>温度>底物浓度>接种量>氮磷比。

表3 正交实验结果与分析