一株Thuidium cymbifolium内生细菌的鉴定及其抑制真菌活性研究

谢 颖，刘祎炜，刘安巧，曲如梦，雷梦瑶，王新广，张莉娜，罗先群

(海南大学生命科学与药学院，海南 海口 570228)

植物内生菌是指在健康植物的组织或细胞间隙中生活的一类微生物，不会引起宿主产生明显的病理症状，主要是真菌、细菌和放线菌[1]。植物内生菌与宿主植物协同进化，植物给内生菌提供营养，内生菌产生有生物活性的代谢产物，如抗生素类物质、水解酶、植物生长调节剂、生物碱等，通过与病原菌竞争营养物质、诱导植物产生抗性、促进宿主植物生长或增强抵抗力等几种机制来防治植物病害[2]。赵媛等[3]从对叶红景天中分离出的24 株菌中有12株菌对蚕豆荚枯萎病病原菌、菜豆黑斑病病原菌、茄镰刀菌Ⅰ、茄镰刀菌Ⅱ有不同程度的抑制作用，抑菌圈直径均在5 mm以上。柳志强等[4]发现催吐萝芙木内生菌BacillussubtilisLYM3对10种植物病原真菌均有较强的拮抗作用，抑菌率均在60%以上，其中对香蕉炭疽病病原菌的抑菌率达到83.5%。以上研究均说明植物内生菌在农作物病害防治方面有巨大的应用潜力。

苔藓植物是高等植物中构造最简单的一类植物，全世界约有苔藓植物24 000种，种类仅次于种子植物，且分布十分广泛[5-6]。苔藓内生菌代谢产物具有显著的细胞毒性，能够抑制癌细胞生长[7-9]。

白绢病、香蕉枯萎病及芒果炭疽病等植物真菌病害严重影响作物和果蔬的生长。通过内生菌或其产生的活性代谢产物来对植物病害进行生物防治，能够促进植物生长、避免化学杀菌剂污染，在现代农业生产中日益受到重视[2]。龚国利等[10]对植物内生芽孢杆菌在微生物农药、抗菌、抗肿瘤、生物法修复环境等方面的应用研究进行了综述。目前，对藓类内生菌防治植物真菌病害的研究尚未见报道。鉴于此，作者首次对海南大羽藓(Thuidiumcymbifolium)内生细菌进行分离、纯化和分子鉴定，通过平板对峙实验和发酵液抑菌实验测定其对常见植物病原菌的抑制效果，以丰富药用植物内生细菌的生防资源，为发掘新型内生细菌活性代谢产物奠定基础。

1 实验

1.1 苔藓样品与受试真菌

大羽藓(Thuidiumcymbifolium)，采自海拔1 330 m的海南省省级自然保护区鹦哥岭(19°2′34″N，190°33′7″E)。大羽藓样品生存环境是腐烂树木的根部，采集后储存于海南大学生命科学与药学院生物工程系实验室。

受试真菌为蔓枯病、稻瘟病、白绢病、香蕉枯萎病、立枯丝核病和芒果炭疽病等病原菌，由海南大学生命科学与药学院生物科学系实验室提供。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL。

PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。马铃薯切块，煮沸30 min后，纱布过滤收集滤液。

1.3 内生细菌的分离纯化

将采集的新鲜大羽藓样品洗净，在超净工作台内，浸泡于75%乙醇中表面消毒1～2 min后用无菌水冲洗4次，然后用5%NaClO溶液浸泡2～3 min，再用无菌水清洗4次[11]。用无菌水检验法和组织痕迹法验证。将表面消毒合格的大羽藓叶片充分研磨，加入200 μL无菌水稀释，涂布于PDA培养基上，28 ℃培养数天后，得到不同形态的菌落。将不同形态的菌落分别进行梯度稀释，选取合适的稀释梯度，取100 μL稀释液涂布于平板上，37 ℃培养1 d，得到多个单菌落。多次重复分离纯化步骤，直到培养基上长出的单菌落均为同一种菌为止。将纯化后的菌株转移至试管斜面培养基上，37 ℃培养6～8 d，然后放入4 ℃冰箱中保存，备用。

1.4 生长曲线的绘制

将保存于试管斜面的内生细菌TC01接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃、160 r·min-1振荡培养1 d，得到活化种液。取30支洁净的试管，各加100 μL种液及5 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃、160 r·min-1振荡培养；测定培养液在560 nm处的OD560值，每次取3支不同试管的培养液进行测定并取平均值，绘制生长曲线。

1.5 内生细菌TC01的分子生物学鉴定

内生细菌TC01进行纯培养得到单菌落，送赛默飞世尔仪器有限公司广州分公司进行测序。扩增引物为：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。将内生细菌TC01的16S rDNA序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对，选择并下载同源性最高的几条序列。使用ClustalW对搜集的序列进行多序列比对[12]，根据比对结果使用MEGA X软件采用邻接法构建系统进化树，Bootstrap分析中使用1 000次重复计算NJ树的支持率。

1.6 内生细菌TC01与受试真菌的平板对峙实验

PDA培养基高温灭菌，超净工作台紫外消毒30 min。在超净工作台内倒平板，用无菌打孔器在PDA平板中心打取直径约6 mm的饼，将受试真菌菌饼接入其中，挑取内生细菌TC01在距离中心约2 cm处两边划两条平行菌线，以仅接入受试真菌的平板作为空白对照。28 ℃培养2～4 d，观察实验组和对照组真菌的生长状况，用游标卡尺测量真菌菌落直径，并按下式计算抑菌率：

式中：D为对照组受试真菌菌落直径；d为实验组受试真菌菌落直径。

1.7 内生细菌TC01发酵液抑菌实验

将保存于试管斜面的内生细菌TC01接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃、160 r·min-1摇床培养5 d；将发酵液于4 000 r·min-1离心10 min，取上清液。将一部分发酵液和PDA培养基按3∶7的比例进行混合后高温灭菌倒平板；一部分发酵液用滤膜除菌，与已灭菌的PDA培养基按3∶7的比例混合后倒平板，研究发酵液除菌方式对抑菌效果的影响。用打孔器将受试真菌的菌饼接入平板中央，每组设3个平行实验，以未混有内生细菌发酵液的培养基接入真菌菌饼作为对照，28 ℃培养，观察实验组和对照组真菌的生长状况，每天用游标卡尺测量真菌菌落直径，计算抑菌率。使用SPSS 17.0进行显著性差异分析。

2 结果与讨论

2.1 内生细菌TC01的菌落形态

从海南大羽藓叶片中分离纯化得到了内生细菌TC01，其菌落形态在培养前期为白色不透明，形状呈圆形凸起，边缘整齐，表面光滑有光泽；在培养后期边缘向四周发散，形状呈不规则棒状。

2.2 内生细菌TC01的生长曲线

以OD560值为纵坐标、培养时间为横坐标，绘制内生细菌TC01的生长曲线，如图1所示。

图1 内生细菌TC01的生长曲线Fig.1 Growth curve of endophytic bacterium TC01

由图1可知，1～2 d为对数生长期，内生细菌TC01快速生长；2～6 d为稳定期，内生细菌TC01的生长趋缓；6 d后，内生细菌TC01的生长曲线缓慢下降。与普通细菌相比，内生细菌TC01的生长周期明显更长。

2.3 内生细菌TC01的分子生物学鉴定

根据内生细菌TC01的16S rDNA测序结果进行序列比对、构建系统进化树，结果如图2所示。

图2 内生细菌TC01的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of endophytic bacterium TC01

由图2可知，内生细菌TC01与Viridibacillus(绿芽孢杆菌)在同一个分支，同源性最高为99.86%，结合菌落特征，可判断内生细菌TC01为绿芽孢杆菌。

2.4 内生细菌TC01与受试真菌的平板对峙实验

内生细菌TC01与白绢病病原菌的平板对峙实验结果如图3a所示，内生细菌TC01对4种受试真菌的最大抑菌率如图4所示。

由图4可知，内生细菌TC01对4种受试真菌均表现出了较明显的抑制作用(最大抑菌率均在50%以上)，其中对芒果炭疽病病原菌的抑制作用最明显，最大抑菌率可达83.0%。

图3 平板对峙实验(a)及发酵液抑菌实验(b)Fig.3 Plate confrontation experiment(a) and fermentation broth antifungal experiment(b)

注：不同字母之间表示差异显著(P<0.05)

2.5 内生细菌TC01发酵液抑菌实验

内生细菌TC01发酵液对白绢病病原菌的抑菌实验结果如图3b所示。不同除菌方式下，内生细菌TC01发酵液对6种受试真菌的最大抑菌率如图5所示。

注：不同字母之间表示差异显著(P<0.05)

由图5可知，(1)在抑菌效果方面，内生细菌TC01发酵液对白绢病病原菌、立枯丝核病病原菌的抑制作用非常显著。在高温灭菌和过滤除菌方式下，内生细菌TC01发酵液对白绢病病原菌的最大抑菌率分别达到88.7%和92.8%，对立枯丝核病病原菌的最大抑菌率分别达到92.6%和91.9%；(2)在发酵液除菌方式方面，通过高温灭菌和过滤除菌处理的内生细菌TC01发酵液对白绢病、香蕉枯萎病、立枯丝核病和芒果炭疽病等4种病原菌的最大抑菌率差别不大，而对蔓枯病病原菌、稻瘟病病原菌的最大抑菌率存在显著性差异，其中过滤除菌的发酵液对蔓枯病病原菌的抑菌率比高温灭菌的高约40%。究其原因，可能是由于内生细菌TC01抑制蔓枯病病原菌的有效成分是不耐高温的物质，如多肽、水解酶等，或是在高温下易挥发的物质。程媛媛等[13]从华重楼内生菌发酵液中分离出一种抗菌肽，由7种氨基酸组成，对玉米弯孢病病原菌等真菌和大肠杆菌等细菌有较强的抑制作用；Maddau等[14]从橡木内生菌的液体培养物中分离并鉴定了多肽抗生素的混合物，该混合物对7种重要的林木病原菌显示出强大的抗真菌活性；Yuan等[15]从银杏中分离出一株解淀粉芽孢杆菌，从其乙酸乙酯提取物中获得了脂肽类抗真菌化合物，在体外对毛双孢属真菌和可可毛色二孢菌表现出强大的生长抑制活性。但是内生细菌TC01发酵液对稻瘟病病原菌的抑制情况却不同，高温灭菌的抑菌率比过滤除菌的抑菌率要高，需要进一步实验(代谢物的分离纯化和结构鉴定)确定原因所在。

2.6 抑菌机理探讨

生物防治植物病害的主要机制包括分泌抗菌物质、与病原菌竞争营养和生态位、诱导植物抗性以及促进植物生长等[16]。平板对峙实验中，所有受试真菌菌饼都没能生长越过内生细菌TC01的细菌线(图3a)，可以认为其抑制真菌的机理可能是与病原菌竞争营养和生态位。罗琳等[17]从红枣中分离获得的解淀粉芽孢杆菌T12主要依靠菌体本身与病原菌竞争营养和重寄生作用产生纤维素酶对葡萄灰霉菌发挥拮抗作用。

发酵液抑菌实验中，受试真菌虽然能生长，但是较对照组来说生长非常缓慢，而且菌丝发育不良，可以认为内生细菌TC01可能产生有抑制真菌生长的抗生素、水解酶类、生物碱等活性物质或者抑制孢子萌发，造成病原菌菌丝畸形。刘先宝等[18]筛选获得一株劳尔氏菌，其乙酸乙酯相提取物能够抑制香蕉枯萎病病原菌菌丝果胶酶活性和蛋白质的含量，并通过破坏细胞膜结构产生抑菌作用；布婷婷等[19]发现了一株枯草芽孢杆菌Y13对油茶炭疽病病原菌菌丝有抑制、致畸作用，还能抑制分生孢子的萌发。

3 结论

从海南大羽藓叶片中分离纯化得到一株内生细菌TC01，不仅丰富了热区苔藓内生细菌的资源，也为海南作物和水果病害的生物防治奠定了基础。内生细菌TC01具有较好的生防潜力，有深入研究和开发的价值。