基于多指标权重分析和单因素-正交实验优选前列爽颗粒醇提工艺

赵婷婷，何承辉，谭梅娥，孙玉华*

(1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)

前列爽颗粒，是新疆维吾尔自治区中医医院按照现代中医理论组方的经验方，有多年的临床应用。具有清热利湿、活血通溺、补虚导浊的功效，用于治疗脾肾两虚、湿热瘀阻所致慢性非细菌性前列腺炎[1]。处方由关黄柏、王不留行(炒)、车前子等五味药材组成，其中关黄柏含有生物碱类等有效成分如盐酸小檗碱、药根碱、巴马汀等[2]，王不留行(炒)含有黄酮类等有效成分如王不留行黄酮苷等[3]，车前子含有苯乙醇苷类等有效成分如毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等[4]。这些成分具有抗菌、抗癌、抗炎、降脂等作用[2-4]。

作者在单因素实验的基础上，以醇提液中盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的转移率及醇浸膏得率为评价指标，对指标权重系数计算方法进行比较分析，设计L9(34)正交实验对乙醇体积分数、料液比、提取时间等因素进行考察，构建前列爽颗粒醇提工艺优选模型，并进行验证实验，为前列爽颗粒的研发提供稳定、可行的生产工艺。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

关黄柏、车前子、王不留行(炒)，购于亳州华云中药饮片有限公司，均符合《中华人民共和国药典》(一部)2015 年版相关项规定。

盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212)、王不留行黄酮苷对照品(批号111853-201704)、毛蕊花糖苷对照品(批号111530-201512)，中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈，色谱纯，美国Fisher公司；自制超纯水。

KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；UV-765型紫外分光光度仪，上海精科；DZKW型电热恒温水浴锅，北京光明医疗仪器厂；BP211D型、BS110S型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司； KDM型调温电热套，山东鄄城永兴仪器厂；超纯水机，四川沃特尔水处理设备有限公司。

1.2 溶液的制备

1.2.1 盐酸小檗碱对照溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品，用60%乙醇溶解，配制成浓度为534 μg·mL-1的储备液；再精密量取1.5 mL储备液，置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，摇匀，即得浓度为80.1 μg·mL-1的盐酸小檗碱对照溶液。

1.2.2 王不留行黄酮苷对照溶液的制备

精密称取王不留行黄酮苷对照品，用70%甲醇溶解，配制成浓度为551 μg·mL-1的储备液；再精密量取1 mL储备液，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，摇匀，即得浓度为55.1 μg·mL-1的王不留行黄酮苷对照溶液。

1.2.3 毛蕊花糖苷对照溶液的制备

精密称取毛蕊花糖苷对照品，用60%甲醇溶解，配制成浓度为556 μg·mL-1的储备液；再精密量取3 mL储备液，置于10 mL容量瓶中，用60%甲醇定容，摇匀，即得浓度为166.8 μg·mL-1的毛蕊花糖苷对照溶液。

1.2.4 供试溶液的制备

分别称取处方量的关黄柏、王不留行(炒)、车前子，加入乙醇，加热回流提取，过滤，滤液置于1 000 mL容量瓶中，定容，即得供试溶液。

1.2.5 阴性对照溶液的制备

分别称取处方量的药材3份，每份分别缺关黄柏、缺王不留行(炒)、缺车前子，按1.2.4方法制备阴性对照溶液。

1.3 色谱条件

参照《中华人民共和国药典》(一部)2015年版中关黄柏、王不留行(炒)、车前子药材的含量测定方法[5]选择色谱条件。

盐酸小檗碱的色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液[0～60 min，25∶75(体积比，下同)；加入磷酸二氢钠使其浓度达到0.02 mol·L-1]为流动相，检测波长345 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL·min-1，理论板数以盐酸小檗碱色谱峰计应不低于4 000。

王不留行黄酮苷的色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液(0～40 min，10∶90；40～60 min，25∶75；60～70 min，10∶90；70～75 min，10∶90；加入磷酸二氢钠使其浓度达到0.02 mol·L-1)为流动相，检测波长280 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL·min-1，理论板数以王不留行黄酮苷色谱峰计应不低于4 000。

毛蕊花糖苷的色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%醋酸溶液(0～20 min，13∶87；20.01～50 min，17∶83；50.01～55 min，13∶87)为流动相，检测波长334 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1，理论板数以毛蕊花糖苷色谱峰计应不低于5 000。

1.4 醇浸膏得率的测定

先将蒸发皿恒重，再精密吸取25.0 mL供试溶液于蒸发皿中，置于水浴锅上蒸干，于105 ℃烘箱中干燥3 h后立即取出，于干燥器中冷却30 min，精密称定，按下式计算醇浸膏得率：

1.5 醇提工艺的优化

前期单因素实验表明，对提取率影响较大的是乙醇体积分数、料液比、提取时间。因此，选择乙醇体积分数、料液比、提取时间为考察因素，以盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的转移率和醇浸膏得率为评价指标，进行L9(34)正交实验优化前列爽颗粒醇提工艺。

2 结果与讨论

2.1 HPLC图谱(图1)

a.盐酸小檗碱对照 b.盐酸小檗碱样品 c.盐酸小檗碱阴性对照 d.王不留行黄酮苷对照 e.王不留行黄酮苷样品

由图1可以看出，盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的HPLC图谱的峰形良好，分离度佳，阴性无干扰。表明所选择的色谱条件可用于盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的含量测定。

2.2 正交实验结果

在单因素实验的基础上，分别称取关黄柏、王不留行(炒)、车前子各15 g，按表1设计L9(34)正交实验，提取2次，滤液置于1 000 mL容量瓶中，定容，进样测定含量，计算盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的转移率和醇浸膏得率，结果见表1。

表1 正交实验设计与结果/%

2.3 指标权重系数计算方法

2.3.1 AHP法

AHP(层次分析)法是主观权重赋权法[6]。根据前列爽颗粒中处方配伍特点、活性成分含量及药理作用，将表1中盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的转移率和醇浸膏得率等4个指标给予量化，确定4个指标的重要程度为：盐酸小檗碱转移率>王不留行黄酮苷转移率>毛蕊花糖苷转移率>醇浸膏得率，据此进行成对比较，得到4个指标的优先矩阵(表2)[7]。采用AHP 法计算得到盐酸小檗碱转移率、王不留行黄酮苷转移率、毛蕊花糖苷转移率、醇浸膏得率等4个指标的权重系数分别为0.482 41、0.271 80、0.157 51、0.088 29。

表2 成对比较4个指标的优先矩阵

采用AHP法计算权重系数时，需要按式(1)进行一致性检验：

CR=CI/RI

(1)

式中：CR为随机一致性比率；CI为一致性指标；RI为平均随机一致性指标。经计算，CR=0.0056<0.1，判定该矩阵符合一致性检验，所得权重系数有效[8]。

2.3.2 CRITIC法

CRITIC(指标重复性相关)法是客观权重赋权法，综合了指标间的对比强度和冲突性两种权重[9]。对比强度使用标准差进行衡量，标准差越大则权重越大；冲突性使用指标之间的相关系数进行衡量，指标之间相关性越强则冲突性较低，权重越小；综合权重为指标变异性与冲突性指标之间的乘积；最终权重是由综合权重进行归一化计算得到。常用于多指标综合评价中。

利用SPSS 21.0软件，将表1中的数据按式(2)进行线性插值处理，消除单位量纲并计算指标间的对比强度(si)、冲突性(δi)、综合权重(ci)、权重系数(ωi)[10]，结果见表3。

(2)

表3 CRITIC法权重系数计算结果

由表3可知，采用CRITIC法计算得到盐酸小檗碱转移率、王不留行黄酮苷转移率、毛蕊花糖苷转移率、醇浸膏得率等4 个指标的权重系数分别为0.332 1、0.307 1、0.150 0、0.210 8。

2.3.3 AHP-CRITIC 混合加权法

AHP法量化了4个评价指标之间的重要程度并进行两两比较，体现了中药复方“君臣佐使”的特点，得到了以主观信息为基础的权重系数[7]；CRITIC法计算得到的权重系数更加客观[11]。将主、客观结合起来，按式(3)计算综合权重系数(ω综合ij)：

(3)

式中：ωAHPij为AHP法计算的权重系数；ωCRITICij为CRITIC法计算的权重系数；i为第i个因素；j为第j个样本。

采用AHP-CRITIC 混合加权法计算得到盐酸小檗碱转移率、王不留行黄酮苷转移率、毛蕊花糖苷转移率、醇浸膏得率等4个指标的综合权重系数分别为0.560 3、0.291 9、0.082 6、0.065 1。

2.3.4 3种权重系数计算方法的比较

分别按3种方法计算权重系数，对表1数据进行综合评价，结果见表4。

表4 3种权重系数计算方法评价结果的比较

由表4可知，3 种权重系数计算方法所得到的综合评分差异较小。参考综合评分，采用SPSS 21.0软件对3种权重系数计算方法进行相关性处理，可得AHP 法与CRITIC 法之间显著相关(R=0.990，P<0.01)；AHP-CRITIC混合加权法与AHP法、CRITIC 法之间显著相关，其R分别为0.996(P<0.01)和0.974(P<0.01)。说明AHP 法、CRITIC 法及AHP-CRITIC混合加权法具有一致性的评分结果。参考权重系数，对 AHP法与 CRITIC法进行相关性处理，结果显示，其相关性不显著(R=0.819，P>0.05)，所反映的信息不具叠加性。综合分析可得，AHP-CRITIC 混合加权法兼顾主观和客观分析，结合了AHP法与CRITIC法的优势，综合评分结果更为合理、可靠。

2.4 最佳醇提工艺[12]

采用AHP-CRITIC混合加权法计算权重系数，对实验结果进行综合评分，直观分析与方差分析结果分别见表5、6。

由表5可知，对提取率影响最大的因素是A，影响最小的因素是B。由表6可知，对实验结果有显著影响的因素是A和C。若考虑工业生产成本，综合各因素对生产过程及结果的影响，确定前列爽颗粒的最佳醇提工艺为A2B2C3，即：乙醇体积分数70%、料液比1∶10 (g∶mL)、提取时间1.5 h、提取次数2次。

表5 直观分析

表6 方差分析

2.5 验证实验

按处方量称取关黄柏、王不留行(炒)、车前子，在最佳工艺条件下进行醇提，测定盐酸小檗碱转移率、王不留行黄酮苷转移率、毛蕊花糖苷转移率和醇浸膏得率，结果见表7。

表7 验证实验结果

由表7可知，综合评分的RSD<2.0%。表明优选工艺稳定、合理，可用于前列爽颗粒的醇提。

2.6 讨论

(1)在进行HPLC含量测定时，本研究首先考虑采用相同色谱条件同时测定3种成分，结果发现3种药材成分相互之间干扰较大，色谱峰分离差，未能较好地分离样品，故仍参照《中华人民共和国药典》(一部)2015年版中3种药材含量测定方法选择色谱条件分别测定盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷。

(2)车前子中毛蕊花糖苷对肾脏有保护作用，具有减少肾蛋白及抑制肾纤维化的作用[13]。本研究发现，毛蕊花糖苷在提取液中极易降解，与文献报道[14]一致。故将提取液快速浓缩后制成固体颗粒，从而抑制了毛蕊花糖苷的降解。

(3)中药复方制剂成分相对比较复杂，采用多指标综合评价已经成为现代研究中药复方制剂的重要方法之一[15]，AHP-CRITIC混合加权法融合主观和客观两种方法的优点，比单一赋权法更科学，合理性更强[16]。本研究将多指标权重分析和单因素-正交实验设计相结合，既验证了单因素-正交实验结果，同时避免了因自定义权重造成的研究结果的主观性，将两者结合，得到的研究结论更加客观和全面。

3 结论

结合中药复方提取工艺的特点和实际情况，采用AHP-CRITIC混合加权法，在单因素实验的基础上，采用正交实验得到前列爽颗粒的最佳醇提工艺为：乙醇体积分数70%、料液比1∶10 (g∶mL)、提取时间1.5 h、提取次数2次，在此条件下，盐酸小檗碱、王不留行黄酮苷、毛蕊花糖苷的平均转移率分别为81.57%、64.49%、88.15%，醇浸膏平均得率为39.38%，平均综合评分为97.67(RSD=1.98%，n=3)。该提取工艺重复性好、稳定可行，可用于工业化生产。