血清miR-29b、miR-126 与老年糖尿病视网膜病变的相关性分析

戴林雄 何 斐 泮瑛瑛 张 伟 应 巧

糖尿病视网膜病变（DR）是导致患者失明的主要原因[1]。我国DR 的患病率为24.7%～37.5%，其具体发病机制至今尚未完全清楚，给患者身心健康和生活质量带来严重影响[2]。寻找DR 致盲相关标志物对DR 诊治具有重要意义。微小核糖核酸（miRNA）作为一种高度保守的短小RNA，在细胞增殖、凋亡，肿瘤发生、免疫反应及血管新生等多种生物学行为中有重要作用[3-4]。本研究拟检测老年DR 患者血清miR-29b、miR-126 水平，探讨血清miR-29b、miR-126 水平异常与老年DR 发病及进展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江省台州市立医院2017 年5 月—2019 年11 月收治的老年DR 患者126 例作为研究对象。依据2002 年国际糖尿病性视网膜病变分期标准[5]对DR 患者分期，将单纯2 型糖尿病患者纳入DM 组（42 例），非增殖性糖尿病视网膜病变作为NPDR 组（40 例），增殖性糖尿病视网膜病变为PDR 组（44 例），同时，选取40 名年龄≥60 岁的老年体检者作为对照组。本研究经本院伦理委员会审核通过（批准编号：伦审-2017-0039）。受试者均签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）糖尿病患者均符合《中国2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》中2 型糖尿病的诊断标准[6]；（2）经裂隙灯显微镜、间接检眼镜和眼底血管造影检查确诊为DR；（3）年龄≥60 岁。排除标准：（1）患有微血管异常者；（2）临床资料不详细；（3）恶性肿瘤及其他眼内疾病者。

1.3 试剂及仪器 Trizol 总RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号15596018）；逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司，批号B532435-0020、B532461-0001）；紫外分光光度计（美国HACH 公司，型号：DR6000 型）；荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司，型号：7500 型）；血糖仪（德国罗氏诊断有限公司，型号：Accu-Chek Active）。

1.4 指标测定 （1）测静息状态下右臂肱动脉收缩压（SBP）、舒张压（DBP）；（2）早晨空腹抽取受试者外周静脉血15mL，测定糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等指标；（3）另抽取两管5mL 静脉血于EDTA 抗凝管中，离心后分离血清备检。利用Trizol 总RNA 提取试剂盒提取血清总RNA，紫外分光光度计检查样品RNA 浓度，取A260/A280≥1.80 样品完成后续实验。将总RNA 逆转录成cDNA（按Qiagenmi Script Reverse Transcripition Kie 说明书进行）。取逆转录产物为模板，利用定量PCR 试剂盒以及miR-29b 和miR-126与管家基因U6 为内参的特异性引物进行实时定量PCR 检查（miRNA-29b 上游引物5'-UAGCAUCACAGAAAUAUUGGC-3'，miRNA-29b 下游引物5'-CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3'；miRNA-126 上游引物5'-UGAGAACUGUAUUCCAUGGGUU-3'，miRNA-126 下游引物5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGUGUU-3'；U6 上游引物5'-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGTAT-3'，U6 下游引物5'-TCTCCAGGCGGCACGCAGAATG-3'。以上引物由上海丰寿实业有限公司合成），所有反应均设置3 个复孔，反应条件为95℃15min、94℃ 15s、58℃ 30s、70℃ 30s，30 个循环。采用实时定量PCR 仪进行检测，以U6 为内参照，使用2-ΔΔCT 法计算miRNA-29b 和miRNA-126 相对表达量。（4）使用血糖仪测量患者空腹血糖（FBG）及餐后2h 血糖（2hPG）。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析比较不同组血清miR-29b、miR-126、FBG、2hPG、HbA1c，多重比较采用LSD-t 检验；计数资料采用χ2检验的采用率和构成比描述；采用二分类Logistic 逐步回归分析探讨老年糖尿病患者视网膜病变的影响因素，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组研究对象一般资料比较 四组研究对象的性别、年龄及BMI 比较均无明显差异（P＞0.05），NPDR 组和PDR 组糖尿病病程明显大于DM 组，PDR 组糖尿病病程明显大于NPDR 组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组研究对象一般资料比较（）

表1 各组研究对象一般资料比较（）

注：对照组为老年体检者；DM 组为单纯2 型糖尿病患者；NPDR 组为非增殖性糖尿病视网膜病变患者；PDR 组为增殖性糖尿病视网膜病变患者；BMI 为体质指数；“-”为无比项数据；与DM 组比较，aP＜0.05；与NPDR 组比较，bP＜0.05

2.2 四组生化指标比较 四组血清miR-29b 和miR-126 水平比较差异均有统计学意义（P＜0.01），其中PDR 组血清miR-29b 水平明显高于对照组、DM组及NPDR 组（P 均＜0.01），miR-126 水平明显低于对照组、DM 组及NPDR 组（P 均＜0.01）；NPDR 组血清miR-29b 明显高于DM 组和对照组（P＜0.05），miR-126 明显低于DM 组和对照组（P＜0.05）；NPDR组及PDR 组SBP、DBP 明显高于对照组（P＜0.05），NPDR 组、PDR 组及DM 组FBG、2hPG、HbA1c、TG、TC、HDL-C 水平明显高于对照组（P＜0.05），PDR 组FBG、2hPG、HbA1c、TG 水平明显高于DM 组（P＜0.05）。见表2。

2.3 影响糖尿病患者视网膜病变单因素分析 DR患者年龄、糖尿病病程、血清miR-29b、miR-126、HbA1c、FBG 等因素具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 影响糖尿病视网膜病变的多因素分析 以视网膜病变为因变量（无=0、有=1），以表3 中有意义的变量为自变量进行二分类Logistic 逐步回归分析，结果显示，年龄＜75 岁、血清miR-126≥2.43ng/μL 为老年糖尿病患者视网膜病变的保护因素，糖尿病病程≥7.00 年、血清miR-29b≥8.38ng/μL、HbA1c≥6.00%、FBG≥8.15mmol/L 为老年糖尿病患者视网膜病变的危险因素。见表4。

3 讨论

DR 是一种具有特异性改变的眼底病变，最主要的病理特征是视网膜微血管出现功能障碍[7]。DR 是糖尿病患者的常见并发症，占比高达40.3%[8]，目前研究认为DR 的发病是由多种因素综合作用的结果，主要包括高血糖、代谢异常、蛋白质非酶促糖基化、血流动力学障碍、氧自由基形成、凝血机制异常及血管增生因子等因素。既往有研究显示，视网膜早发性小胶质细胞活化、白细胞介素-18 mRNA 及其蛋白表达增加，表明视网膜病可能是由调控新生血管内皮细胞迁移与定位的基因促使[8-9]。

miRNA 不仅对哺乳动物细胞的生长、增殖、凋亡具有调节作用，同时在干细胞的分化过程中也发挥重要作用。DR 的发生发展需要细胞间的信号转导，miRNA 也介导参与了DR 发生发展过程[10-11]。血清miR-29b 是微小RNA-29 家族（microRNA-29）成员之一，其通过miR-29 家族在酸性富含半胱氨酸分泌型蛋白、层黏连蛋白及I、Ⅳ型胶原蛋白等是DR 上起重要作用[12]。miR-126 作为miRNA 重要类型，定位于表皮生长因子样结构域7（EGFL7）基因3′UTR 内含6、7，可影响EGFL7 对新生血管内皮细胞移动与定位的调控功能[13]。研究表明，上调miR-126 表达可促进血管新生，并可维持血管内皮细胞稳定及完整性；亦有研究指出，miR-126 可通过降低血管内皮生长因子（VEGF）水平而影响内皮细胞功能[14-15]。

表2 各组生化指标比较（）

表2 各组生化指标比较（）

注：对照组为老年体检者；DM 组为单纯2 型糖尿病患者；NPDR 组为非增殖性糖尿病视网膜病变患者；PDR 组为增殖性糖尿病视网膜病变患者；SBP 为收缩压；DBP 为舒张压；FBG 为空腹血糖；2hPG 为餐后2h 血糖；HbA1c 为糖化血红蛋白；TG 为三酰甘油；TC 为总胆固醇；HDL-C 为高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C 为低密度脂蛋白胆固醇；miR-29b 为微小核糖核酸-29b；miR-126 为微小核糖核酸-126；1mmHg=0.133kPa；与对照组比较，aP＜0.05；与DM 组比较，bP＜0.05；与NPDR 组比较，cP＜0.05

表3 影响糖尿病患者视网膜病变单因素分析[n（%）]

表3 影响糖尿病患者视网膜病变单因素分析[n（%）]（续）

表4 老年糖尿病患者视网膜病变的影响因素Logistic 回归分析

本研究结果显示，PDR 组血清miR-29b 水平明显高于对照组、DM 组及NPDR 组（P＜0.01），miR-126水平明显低于对照组、DM 组或NPDR 组（P＜0.05）；NPDR 组血清miR-29b 明显高于DM 组和对照组（P＜0.05），miR-126 明显低于DM 组和对照组（P＜0.05 ）；表明血清miR-29b 水平随病情加重而升高，与DR 患者的总体生存率独立相关，DR 患者血清miR-29b 表达水平与DR 发病、转移和预后密切相关，也在DR 发病中发挥重要作用，DR 患者血清高表达的miR-29b 可能通过促进视网膜血管生成而促进发病及病程进展；此外血清miR126 水平在DR 患者明显降低，可能参与DR 发病过程，表明miR126可较好地判别糖尿病患者发生DR，可能成为早期发现糖尿病患者发生DR 的血液指标。多因素Logistic逐步回归分析探讨DR 患者的危险因素，结果显示，患者年龄＜75 岁、血清miR-126≥2.43ng/μL 为老年糖尿病患者视网膜病变的保护因素，糖尿病病程≥7.00 年，血清miR-29b≥8.38ng/μL、HbA1c≥6.00%、FBG≥8.15mmol/L 为老年患者糖尿病视网膜病变的危险因素，可能是因为病程越长，机体各项功能减退越严重，代谢能力随之降低，易导致血管病变发生，从而对视网膜病变起到一定的推动作用，同时提示血清miR-29b、miR-126 与DR 发生、发展密切相关。

综上所述，老年DR 患者血清miR-29b 水平升高，miR-126 水平降低，二者可能成为早期发现DR的血清生物标志物。