IVF-ET 中受精失败高危因素及后续处理的研究进展

胡瑞雪 ，霍鹏 ，张顺

（1.桂林医学院附属医院生殖医学中心， 广西 桂林；2.桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林）

0 引言

世界卫生组织表明不孕症已成为世界第三大顽疾，2017年的生育调查发现我国育龄夫妇中不孕率已高达25.44%[1]。虽然IVF-ET技术是当前治疗不孕症的主要手段，但受限于目前技术，IVF-ET中大概仍然有10%-15%的FF，包括完全受精失败（total fertilization failures，TFF）和部分受精失败，TFF指全部卵母细胞均未受精(受精率=0%)，部分受精失败指卵母细胞受精率≤25%[2]。现今已知的受精过程包括有精子获能、卵丘穿透、精卵融合、皮质卵丘释放、第二极体（2PB）释放及雌雄原核的形成等，且其任一环节出现问题均可能导致FF，因此影响受精的因素必然是众多的。对于FF者将被迫面临无胚可移、取消周期、经济损失等风险，这无疑对患者和医务工作者都造成了一定的创伤。

为明确FF的原因，国内外多个前瞻性及回顾性研究探讨了与FF相关的高危因素，但这些研究的类型、对象及方法等不统一，研究结论也不完全一致。同时，为预防和降低FF，国内外各辅助生殖机构不断探索，但对存在FF高危因素者所采取的受精方式、FF的补救条件及补救方法上目前仍存在差异，且各后续处理的安全性、有效性及经济性也值得探讨。因此，临床及科研工作者亟须一个可靠的指导依据，以助患者取得更好的临床结局。本文通过整理分析目前国内外与此相关的研究，综述了影响FF的高危因素及为预防和降低FF采取的后续处理。以期为研究、预测及干预FF提供一定方向和依据，同时，为FF高危者找到有效、经济及安全的实践措施。

1 IVF 中受精失败的高危因素

（1）男方因素：目前研究发现FF与男方因素最为相关，其中精液参数异常、精子与透明带结合及穿透异常较常见，精子缺少与卵子质膜融合的相关受体或因子及精子原因导致的卵子激活障碍等较罕见[2,3]。Zhu J等[4]通过病因不同对IVF-ET周期进行分组，发现少弱精子症组相较于精液参数正常组发生FF的比例明显升高，Logistic回归模型也显示少弱精子症是FF的独立危险因素。孙青等[5]通过对比IVF-ET中正常受精率组(受精率≥50%)与低受精率组(受精率<50%)组的精子参数，发现精液常规中正常形态前向运动精子总数及处理后活动精子百分率与低受精率呈负相关，二者可作为预测IVF-ET低受精率的指标。薛林涛[6]对IVF-ET周期中精子参数与受精结局行多元回归分析，结果显示受精率与前向运动精子百分率及精子顶体完整率呈正相关，与精子DNA碎片率呈负相关，且三者均是预测IVF-ET周期受精失败或低受精发生的独立指标。同时Liu D等学者在显微镜下观察未受精的卵母细胞，发现42%的卵子内未见精子穿过透明带且精子的顶体反应较紊乱，说明精子与透明带结合及穿透异常阻碍了受精发生[7]。这些研究从宏观上揭示了精子形态及功能的异常可能导致FF的发生，但内在的分子机制仍不明确。有学者将IVF-ET中精液正常男性分为常规IVF-ET妊娠组及R-ICSI妊娠组，对比发现两组间存在精浆蛋白及精子蛋白的表达差异且R-ICSI妊娠组的自发性顶体反应率增加，提示三者的改变可能影响IVF时的受精[8,9]，这将从分子的角度提升对原因不明男性不育的新认识。近期Yan Z等[10]发现，在14个FF或受精不良的独立家系的原发不育男性中有5个出现了PLCZ1突变，对其进行人工卵母细胞激活（AOA）后其中4个被补救成功并产下3名健康婴儿。我们已知PLCZ1在诱导细胞内钙(Ca2+)振荡和启动卵母细胞激活中是必不可少的，这从分子基因的角度揭示了原发不育男性发生FF的原因，但仍需大规模的研究认证。

（2）女方因素：原发不孕及不明原因不孕是FF公认的高危因素，而卵母细胞结构、卵母细胞功能异常基本被认为与FF密切相关[2，3，4]。郝大勇等[11]通过对卵母细胞进行电镜观察，发现IVFET中未受精的卵母细胞透明带比受精的卵母细胞明显增厚，这可能引起精子穿透过程的障碍而发生FF。Li J等[12]对既往ICSI受精失败的卵母细胞均分成常规ICSI后行AOA组（AOA组）及常规ICSI组（非AOA组）受精，发现AOA组的受精率和可移植胚胎率明显高于非AOA组，提示卵母细胞激活障碍与FF的发生密切相关。而Bonte D[13]等使用小鼠卵母细胞激活试验(MOAT)来检测精子相关的卵母细胞激活功能，再对比激活能力正常者的ICSI后FF的AOA周期和既往ICSI周期，发现AOA组的受精率、妊娠率和活产率明显高于既往ICSI组，说明卵母细胞自身的激活缺陷与FF密切相关。由于AOA的过度侵入性，目前多在ICSI后发生FF时使用。近期，Huang L等[14]对出现卵母细胞成熟停滞的9个独立家系的原发性不孕患者进行研究，发现其中4个为双等位基因PATL2突变，提示原发不孕者出现卵母细胞成熟停滞可能与这一基因突变有关，这可能是原发不孕易发生FF的原因之一，但仍需大样本的研究。

（3）其他因素：当然，IVF-ET过程中所涉及的一些不可控因素同样会造成FF的发生，如操作技巧、实验室环境、实验室人员对卵子质量、卵子成熟程度及2PB排出情况的判断等[2]，因此经验丰富的胚胎学家对每一个辅助生殖实验室都是至关重要的。

2 IVF-ET 中受精失败的后续处理

（1）晚补救 ICSI（Late rescue intracytoplasmic sperm injection，L-ICSI）

1994年Lundin K[15]等首次报道用ICSI补救传统IVF（过夜受精）后FF的卵母细胞，即晚补救ICSI，由于卵子最佳受精窗的错失及卵子老化，受精率低于常规ICSI周期。由于L-ICSI相当于取卵后的第二日受精，导致第3天移植的往往是2-4细胞期胚胎，此时胚胎发育与子宫内膜发育不同步，虽受精率有所升高但胚胎种植率极低。因此，有学者将冻融移植和鲜胚移植周期做对比，发现相较于后者，前者胚胎植入率明显改善，建议L-ICSI中的胚胎冷冻保存后用于冻融周期[16]。但因卵子老化、最佳受精窗口期的错失及胚胎与子宫内膜发育的不同步，L-ICSI对FF周期的临床结局并无明显改善。

（2）部分卵胞浆内ICSI (half-ICSI)

1996年Aboulghar M等[17]提出对存在FF高危因素者应行half-ICSI受精，即将取出的卵母细胞随机均分为2组，分别采用传统IVF和ICSI授精。虽改善了此类患者的临床结局，但盲目扩大了ICSI的应用范围，并有部分卵子因未发现FF而未行补救ICSI造成了卵子的浪费。刘苡萱等[18]将IVF-ET中FF高危者分成Half-ICSI组与R-ICSI组，发现Half-ICSI组的ICSI周期率远高于R-ICSI组，其89.8%的ICSI卵子是常规IVF中受精率正常的卵子，属于过度ICSI。且ICSI时绕过了正常的受精过程，逃避了卵子对精子的自然选择，存在将携带父源性异常染色体的精子注入卵子遗传给子代的可能。Bonduelle M等[19]对ICSI获得儿进行了产前检测，发现胎儿染色体异常率明显高于一般人群，且主要为父源性，当存在精液异常时发病率更高，因此应尽量避免过度ICSI。

（3）短时受精联合早期补救ICSI (Rescue-ICSI， R-ICSI)

2003年Chen等[20]提出了R-ICSI的概念，即IVF受精4-6h通过观察2PB的排出情况判断是否受精，对无2PB排出的卵母细胞行补救ICSI，获得了较高的受精率、妊娠率和着床率。He Y等将存在受精失败高危因素的IVF周期分为传统IVF组、短时IVF受精组（受精率>30%）及R-ICSI组（TFF后行R-ICSI)，发现三组间胚胎植入率和临床妊娠率无明显差异，说明 R-ICSI是一种安全、可靠的受精方式，使FF高危者即使发生FF时仍获得了较好的临床结局[21]。即使对目前争议较大的不明原因性不孕，严为巧等采用Half-ICSI及 R-ICSI受精，对比发现二者在正常受精率、优胚率、临床妊娠率及种植率等方面均无统计学差异[22]。当然，也有研究者称当一个周期获得的卵母细胞较少且精子参数正常时，传统IVF的结局优于补救ICSI和ICSI周期[23]。因此R-ICSI受精是否适用于所有的IVF-ET周期仍是不明确的。

L-ICSI因不理想的临床结局，目前临床上已基本弃用。对FF高危者，相较于half-ICSI， R-ICSI既提高了IVF-ET中FF周期的正常受精率，又避免了过度ICSI带来的安全隐患，对预防和改善FF更加精准、有效。

3 R-ICSI 的依据及其优势

3.1 R-ICSI 的理论依据

R-ICSI包括短时受精及早期补救ICSI两部分。传统IVF受精失败后的补救ICSI大多在隔日进行，即L-ICSI，随卵龄的延长细胞核质过度成熟甚至老化，导致卵子最佳受精窗的错失，且卵母细胞暴露于培养液内增加了与毒性物质接触的时间，导致遗传物质畸变及染色体异常的概率升高，不仅影响卵子受精而且降低了胚胎发育潜能，这为R-ICSI奠定了基础。

3.2 短时受精中受精的观察时机及指标

核质成熟的卵母细胞停留在MⅡ期，与精子结合后被激活完成第二次减数分裂并排出2PB，随后再形成雌雄原核，因此，2PB的排出是卵母细胞形态学上最早的受精的标志，是目前判断卵母细胞早期受精的金标准，因此找到2PB的最佳观测时间，以便及时对未受精的卵子行补救ICSI非常重要。有研究表明[24]，卵子一般在精卵共培养2-4h后完成受精过程，6h后大约有90%的受精卵排出第二极体，也有报道发现授精4h超过90%的受精卵排出第二极体[25]。当然，即使授精6 h后仍存在10%左右的卵母细胞出现2PB延迟释放的情况，因此对FF周期行补救ICSI时对存在2PB的卵不建议行ICSI，防止造成多精受精。近期有研究者通过纺锤体观察仪观察IVF中不同受精时间（4h、5h、6h）的卵母细胞，发现受精5小时出现纺锤体是卵母细胞未受精的准确指标，此时结合补救ICSI可有效地防止FF及降低多精受精率[26]。但由于PM价格昂贵，目前并不是每个生殖实验室的常规用品。

3.3 早期补救ICSI 的时间

卵母细胞成熟包括细胞核、质的共成熟，且细胞质成熟需经历复杂的生理生化过程，较细胞核成熟晚，二者同时成熟对受精及后续的胚胎发育至关重要与此同时，在脱颗粒细胞判断是否受精之前，卵子周围的颗粒细胞可为卵母细胞提供促进早期胚胎发育所需的营养物质，而适时的脱除颗粒细胞又可去除对早期胚胎发育有害的物质，并避免颗粒细胞和高密度精子长期存在对胚胎发育的不利影响。王紫娟等研究者[27]发现R-ICSI的受精率并不明显低于常规IVF或首次因男方因素行ICSI的周期，推测可能是因其缩短了精卵共孵育时间的同时，穿刺时间又较常规ICSI周期晚，此时卵母细胞不仅更成熟，且汲取了更多养分并适时脱离了不利因素，从而更利于受精成功。精卵共孵育4-6小时通过观察2PB判断受精是R-ICSI的第一步，找到行补救ICSI的最佳时机是其第二步的关键，既能让卵子仍处于最佳的受精窗口期又使得到的胚胎与子宫内膜可以实现同步化。因此，有学者对补救ICSI时的受精时间进行分组(<6h、6-8h和>8h)，发现临床转归与补救时间呈负相关[28]，补救时间越早临床结局越好。随后，林碎玲等[29]又将补救时间间隔分为(4-5 h、5.1-6 和6.1-8 h )，同样发现补救时间越早胚胎质量及妊娠结局越好。综上所述，结合2PB的排出时间，受精4-6h后拆颗粒对受精失败的卵母细胞立即行补救ICSI仍是目前大多数生殖中心较好的选择。

3.4 R-ICSI 的条件

目前，有些辅助生殖机构对受精率低于50%的未受精卵子行R-ICSI[27]，但有学者称在受精能力较好时，卵丘细胞的早期脱去和补救ICSI将显著增加多原核率[30]。因此，有研究者将受精率<50%行R-ICSI处理的周期分成三组（0%、<25%、>25%)，其受精率分别为74.66%、68.35%和65.46%，多倍体率分别为8.55%、11.33%和14.47%，且第2组可移植胚胎率为38.33%，高于其他两组，发现对受精率<25%的组行补救ICSI可明显提高受精率及优胚率，对受精率>25%组行补救ICSI风险高临床回报低[31]。

3.5 R-ICSI 的安全性

R-ICSI广泛应用的同时，有学者对其安全性表示了担忧，谭艳等[32]的Meta分析结果显示R-ICSI与常规IVF及常规ICSI相比，新生儿的各项出生结局并无统计学差异，也有学者发现R-ICSI与常规IVF和ICSI相比，在保证分娩健康儿童之外其临床妊娠率也相似[33]。综上所述，对存在FF高风险的周期，采用R-ICSI受精将是安全、经济及有效的。但由于研究对象的时间限制，其长远影响仍需继续研究。

4 小结与展望

IVF中影响FF的高危因素是众多的，如精子参数异常，尤其是边缘性合格精液及原发性不孕等。众所周知，大多数FF与男性因素密切相关，为防止FF高危者发生FF，尤其是合并精液参数异常者，R-ICSI应为目前最佳的受精方式，即精卵共孵育4-6 h，通过观察2PB的排出情况判断是否受精，当受精率<25%时立即行补救ICSI。当然找到观察2PB（或其他受精指标）与补救ICSI时机的最佳平衡点及最佳的补救条件，将使患者得到更好的临床结局。目前国内外对FF高危因素及后续处理的研究多为回顾性研究且样本量有限，而回顾性研究本身具有一定的局限性，不能控制研究对象的分布，如年龄这类明显影响受精及胚胎发育的干扰因素，故存在一定的偏倚，需结合受精生物学理论和临床实践。因此，大样本、设计精良、具有所有最新技术优势的前瞻性随机对照试验研究亟须完善。