类泛素化修饰Neddylation 在肿瘤中的研究进展

朱小康，郭博，李新志

（三峡大学医学院，三峡大学附属仁和医院，湖北 宜昌）

0 引言

NEDD8(neuralprecursor cell-expressed developmentally downregulated 8)即神经前体表达发育下调蛋白8，它是一种类泛素蛋白，最先报道是在小鼠胚胎的脑组织中高度富集的新的信使RNA[1]，但后经研究发现NEDD8是由81个氨基酸编码的蛋白质，它和泛素蛋白（ubiquitin）具有80%的相似性和60%的一致性[2]。NEDD8在大多数真核生物(动物、植物、真菌)中高度保守，对真核细胞的生命活动具有十分重要的功能[3]。NEDD8介导的类泛素共价修饰过程称为Neddylation，即NEDD8经E1-E2-E3级联传递后与底物共价结合，从而调节底物的生物学功能。Neddylation修饰调控着许多重要的生命活动，如细胞周期、免疫应答、调节蛋白降解、转录因子活性和DNA修复等多种生物学进程，其功能的失调与神经性病变、炎症反应、免疫缺陷以及肿瘤等病理过程也密切相关[4]。有研究表明小分子抑制剂MLN4924（pevonedistat）可特异性的抑制Neddylation的E1活化酶NAE，通过抑制NAE的活性从而阻断蛋白质的Neddylation修饰通路，可以达到抑制肿瘤相关信号通路的作用；MLN4924在多种肿瘤动物模型中表现出良好的抑瘤效果，现已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验[5-6]。

1 NEDD8 介导的Neddylation 修饰通路

Neddylation是一种类似泛素化的蛋白质翻译后修饰方式，（蛋白质翻译后修饰指的是在mRNA被翻译成蛋白质后，对蛋白质上特定氨基酸残基进行共价修饰的过程）它能将类泛素蛋白NEDD8共价可逆结合于靶标蛋白[7]。Neddylation的过程首先通过C端的蛋白酶水解作用去除第76 位甘氨酸后的一个或多个氨基酸残基，将NEDD8前体加工为成熟形式，随后被NEDD8的E1活化酶（由UBA3和APPBP1组成一个异源二聚体）活化；活化NEDD8转移到E2结合酶UBC12，然后通过E3连接酶结合到特定的底物上，最终完成靶标蛋白的NEDD8偶联[8-10]；底物上的结合的NEDD8也可以被去Neddylation酶介导去除NEDD8分子，去Neddylation后的NEDD8分子可以重新进入循环。

2 去类泛素化修饰Deneddylation

在蛋白的Neddylation循环通路中，去类泛素化（Deneddylation）的反向调控也起重要的作用。去类泛素化的酶能够将NEDD8 从修饰蛋白中解离下来，介导Deneddylation过程的酶包括CSN、NEDP1、USP21、UCH-L1和 UCH-L3等去类泛素化酶，其中CSN和NEDP1是特异性针对NEDD8的去泛素化酶[4,8]。CSN(COP9 signalsome，CSN)是一种目前研究热门的NEDD8去类泛素修饰酶，是最具有特征性的Deneddylation的酶，它在动植物中高度保守[11]；有研究表明CNS在体内能够特异性去除cullin-RING连接酶的类泛素化修饰[12]。神经前体表达发育下调蛋白8特异性蛋白酶1(NEDD8-specific protease 1，NEDP1，又称DEN1)是SENP家族成员之一，又被称为SENP8（Sentrin-specific protease 8），它由212个氨基酸残基组成，是一个进化保守的半胱氨酸蛋白酶，在酵母、植物、昆虫和哺乳动物中存在高度同源性[13，14]。NEDP1虽然可以水解NEDD8的C端促进NEDD8成熟；但其主要功能在于能够促使NEDD8分子解偶联，降低底物Neddylation修饰水平，平衡Neddylation修饰水平在体内的异常上调[15]。但NEDP1在动物体内的生理功能及作用机制仍然不十分清楚。

3 Neddylation 修饰与肝癌

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,目前已知肝癌的发病与肝硬化、病毒性肝炎、黄曲霉素以及某些化学致癌物质和水土因素有关；其中又涉及到原癌基因(如ras、c-myc、HBV X基因)的激活和抑癌基因(如P53、P16、P12、PTEN 基因)的失活，还有某些信号通路的激活都与肝癌的发生有关[16]。有研究表明肝癌的驱动因子人抗原R(HuR)在肝癌中发挥重要作用，其表达上调与肝癌的发生发展、预后密切相关；HuR是一种广泛表达的RNA结合蛋白，属于ELAVL样家族,通过结合靶基因mRNA3’-UTR中富含AU的元件，参与mRNA的稳定化、剪接和翻译过程，从而调节细胞去分化，增殖和存活[17]。在人肝细胞癌中HuR蛋白的表达水平又与癌基因Mdm2的表达呈正相关，有学者研究发现是由于HuR通过Mdm2介导的Neddylation修饰保持核定位的稳定性以防止其被降解[18]；同时HuR蛋白也是NEDD8介导的Neddylation修饰的靶标[19]。另一项研究表明NEDD8介导的Neddylation修饰与肝脏纤维化的发生密切相关[20]，而肝纤维化会进一步转化为肝硬化，临床上部分肝硬化的患者最终会进展为肝癌。有学者研究发现，患者肝癌组织中Neddylation修饰的途径均被过度激活，研究者通过免疫组化（IHC），Western-blot、RT-qPCR分析了来自临床的509例肝细胞癌患者的癌组织和癌旁肝组织中的Neddylation修饰途径（包括NEDD8蛋白、E1激活酶、E2结合酶、E3连接酶），结果显示与癌旁正常的肝组织相比，肝癌组织中Neddylation修饰途径被过度激活，此外，肝癌组织中NEDD8的上调与肝癌的侵袭性相关，并且是肝切除术后肝细胞癌患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的独立危险因素[21]。

4 Neddylation 修饰与结直肠癌

目前已发现报道的NEDD8连接酶有十几种，根据其结构域的不同可分为可分为环指结构(RING finger)、E6AP C-末端同源蛋白(homologous to E6AP C-terminus, HECT)型和U box三大类。smad泛素化调节因子1(smad ubiquitylation regulatory factor 1, Smurf1) Smurf1是属于HECT类型的NeddylationE3连接酶[22]。有学者研究发现Smurf1的Neddylation修饰与结直肠的发生的密切相关，Smurf1可与NEDD8和Ubc12发生相互作用，从而形成NEDD8-硫酯中间体，在多个赖氨酸残基上催化其自身的烯丙基化，这种自身交联化需要HECT 结构中C426处有一个活性位点。Smurf1的Neddylation修饰可以有效地增强泛素酶E2的募集并增强Smurf1的泛素连接酶活性；而Smurf1泛素连接酶活性异常地增强，可加速底物降解，从而促进了结直肠癌的发生[23]。此外，在人结直肠肠癌中，NEDD8，NAE1和Ubc12的表达升高与结直肠癌进展和预后相关。

5 Neddylation 修饰与肺癌

复旦大学肿瘤研究所的一项研究表明，Neddylation修饰通路的过度活化与肺癌的发生发展呈正相关。研究者通过免疫组化，Western-blot、RT-qPCR分析了75例肺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中E1活化酶NAE1和E2结合酶UBC12的表达情况以及总蛋白的Neddylation修饰水平；结果显示在肺腺癌和肺鳞状细胞癌中，NEDD8的E1活化酶NAE1和E2结合酶UBC12表达显著上调，总蛋白的Neddylation修饰水平也明显上调；进一步研究发现Neddylation修饰水平与肺癌患者的预后呈负相关，与Neddylation修饰低表达的肺腺癌患者相比，Neddylation修饰高表达的肺腺癌患者的总生存期较差。此外，用NAE抑制剂MLN4924可显著抑制肺癌细胞的体外增殖和癌细胞迁移，在荷瘤小鼠体内也表现出抑制肿瘤的形成和转移[24]。另一项研究也支持前述观点，研究者发现肺癌组织中UBC12的mRNA水平远高于正常的肺组织，且随着疾病恶化而增加，并与NEDD8表达呈正相关；此外，UBC12的过表达显着增强了蛋白质的Neddylation修饰，而UBC12的下调减少了目标蛋白的Neddylation修饰。进一步研究表明UBC12沉默可抑制Cullin Neddylation修饰，导致CRL E3连接酶失活，并诱导肿瘤抑制性CRL底物（p21，p27和Wee1）的积累，从而诱导肿瘤细胞周期停滞并抑制肺癌的恶性分化[25]。

6 Neddylation 修饰与乳腺癌

Cullins是NEDD8修饰的主要底物，cullins蛋白的Neddylation修饰在泛素介导的蛋白质降解中起重要作用；有研究显示乳腺癌相关蛋白3（BCA3）是NEDD8的底物，BCA3通过Neddylation修饰与p65和Cyclin D1启动子结合从而达到抑制NF-κB转录的作用[26]。研究表明c-Jun NH2末端蛋白激酶（JNK）途径与乳腺肿瘤的发生有关[27]，但其具体作用机制不十分清楚。有学者报道JNK特异性激酶MAP2K、MKK7在人乳腺癌细胞中发生Neddylation修饰。Neddylation修饰可能会通过限制JNK磷酸化来促进乳腺肿瘤的发展[28]。放射疗法是局部控制乳腺癌的有效治疗方案。然而，乳腺癌细胞的放射抗性限制了治疗的效果。有研究表明，MLN4924可以作为用于乳腺癌放射治疗的增敏剂，学者研究发现MLN4924有效的抑制了cullis的 Neddylation修饰使乳腺癌细胞对放射线敏感，其敏感性增强比（SER）对SK-BR-3细胞为1.75，对 MCF7细胞为1.32[29]。

7 总结和展望

越来越多研究结果表明Neddylation修饰与肿瘤的发生发展有着千丝万缕的联系，Neddylation修饰通路广泛参与调控肿瘤的细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬、血管生成以及肿瘤微环境的调节等多种生物学过程[30]；靶向Neddylation通路E1活化酶的抑制剂MIN4924已经被广泛证实可以抑制多种肿瘤细胞的恶性增殖和侵袭，目前正处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验中[5-6]。对这些科学问题的深入研究不仅会加深我们对Neddylation修饰在癌症生物学中作用机制的了解，而且还将有助于开发新的肿瘤标志物以及更具有选择性的靶向抑制剂，为癌症患者的个体化治疗提供新方向。