TPPU 对于缺血性脑卒中神经单元保护的研究历程及现状

黄攀，张琳蕾，易兴阳★，韩钊★

（1.德阳市人民医院，四川 德阳；2. 温州医科大学附属第三医院，浙江 温州）

0 引言

缺血性卒中是严重危害人类健康的重大疾病，发病率高，占所有脑卒中的80%左右，溶栓治疗和神经保护治疗是其两大主要治疗策略。重组组织型纤溶酶原激活（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一获得批准的缺血性卒中的溶栓药物，其溶栓疗效已经在临床实践得到证实[1]。由于受到时间窗狭窄(发病后4.5小时内)和颅内出血风险的限制，限制了溶栓治疗在临床上的广泛应用，因此，神经保护治疗一直是缺血性卒中治疗领域的梦想和希望。近三十年来，针对脑缺血病理生理环节开发了多种神经保护剂，如抗氧化剂、钙通道拮抗剂、兴奋性氨基酸受体抑制剂和神经营养因子等，全球进行了1000多个脑保护实验研究和100多个临床研究，大多在动物实验有效而临床试验无效，导致临床转化失败[2]。迄今尚无有效的神经保护剂获得临床指南推荐[1,3]，但是人类研发有效神经保护剂的探索一直没有终止。2011年美国卒中学术产业圆桌会议（Stroke Academic Industry Roundtable，STAIR)提出了脑卒中神经保护研究推荐意见[4]，这促使我们转换思路，为研发有效脑保护药物奠定基础。

1 脑缺血后神经单元（NCU）损伤和可能的损伤机制

NCU在缺血性脑损伤过程的作用及机制目前还没有阐明，目前研究热点主要集中以下几个方面：（1）TJ结构破坏。缺血缺氧引起内皮细胞TJ相关蛋白的表达以及定位改变，导致脑微血管内皮屏障功能下降。（2）蛋白质磷酸化信号转导途径对BBB通透性改变的调控。其中研究较多的是酪氨酸蛋白激酶（Protein Kinase C，PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径。虽然相关的大量研究证实了这些信号通路参与到对TJ的调控，最终影响BBB的功能，然而具体的信号调控机制还没有阐明。（3）炎症和氧化应激对BBB功能的破坏。脑缺血再灌注时，血管内皮细胞粘附分子表达，促发炎症级联反应，导致炎性细胞粘附聚集和迁移，这是BBB损伤的基础。炎性细胞聚集，产生大量的蛋白水解酶，特别是MMPs，导致血脑屏障的破坏。（4）星型胶质细胞参与对BBB完整性的维持障碍。AQP4主要分布于星型胶质细胞足突，是介导水进入脑组织的最主要蛋白。脑缺血损伤后，AQP4表达升高，水通道开放，大量水分子进入细胞内形成细胞内水肿，引起血脑屏障破坏。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 MAPK信号通路参与对水通道蛋白4的调控。（5）近年研究表明，细胞凋亡在脑缺血中可能起主导作用，脑缺血损伤后缺血半暗带产生的主要病理生理机制之一是细胞凋亡，线粒体结构和功能改变在细胞凋亡中起关键作用[18]。脑缺血后NCU和BBB损伤的线粒体细胞凋亡信号通路是目前关注的热点。

2 线粒体细胞凋亡信号通路在NCU 损伤中的作用

线粒体作为细胞生物氧化和能量转换的主要场所，线粒体的结构、功能异常与脑缺血再灌注损伤发生、发展密切相关。脑缺血后注线粒体功能障碍的机制涉及氧自由基损伤、钙超载、线粒体通透性转换孔( mitochondrial prmeability transition pore，MPTP) 的异常开放、线粒体结构损伤等。（1）线粒体超微结构改变。表现为线粒体内膜结构及线粒体嵴结构的改变：线粒体肿胀、分解、消失、胞质密度增加。（2）线粒体产生自由基功能的改变。自由基被认为主要产于线粒体, 正常情况线粒体氧自由基水平较低, 缺血时其水平就会升高，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）增高。（3）线粒体呼吸链酶和ATP酶活性的变化。线粒体内膜有按一定顺序排列的酶和辅酶，其中酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组成呼吸链。呼吸链中的酶复合体易受到缺氧影响，直接影响了ATP 的生成。（4）线粒体膜电位的变化。缺血/再灌注时的各种有害刺激，如缺氧、线粒体内Ca2+增加，都可造成MPTP 开放，从而引起线粒体膜电位下降，甚至消失，呼吸链断裂造成细胞死亡[19]。（5）线粒体内细胞色素C的改变。线粒体内细胞色素C(cytochrome C，CytC)是核DNA编码的蛋白质，是线粒体电子传递中复合体Ⅲ和Ⅳ之间传递电子的载体，脑缺血时CytC的释放可启动细胞凋亡。（6）线粒体DNA及其表达的改变。线粒体DNA(mtDNA)是氧化磷酸化系统重要酶系的前体物质。mtDNA 的损伤则可引起氧化磷酸化酶功能的改变，还可加速细胞凋亡的发生。（7）脑缺血后细胞能量代谢的恢复是细胞其他功能恢复的基础，若细胞能量代谢障碍持续存在，则必然导致细胞凋亡或坏死，而线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用[20]。脑缺血线粒体损伤可能从以下几方面诱导细胞凋亡：A.线粒体CytC不仅在能量代谢中发挥着重要作用，且其由线粒体内释放入胞质，是启动依赖CytC和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinylaspartatespecificproteinase，caspase）途径细胞凋亡的重要步骤；B.线粒体损伤，ATP生成减少，细胞功能障碍；C.线粒体损伤，炎症反应和氧化应激反应，自由基产生增多，导致mtDNA的损伤、细胞膜损伤；D.线粒体内膜的MPTP的开放形成了线粒体通透性转变( mitochondrial permeability transition，MPT) ，MPT是细胞损伤引起凋亡或坏死的共同通路[21]。脑缺血线粒体损伤结果引起前-凋亡蛋白Bax的活化，该蛋白诱导线粒体释放CytC，形成凋亡小体，启动caspase-9的活化，之后死亡执行因子caspase-3和caspase-7被活化，通过蛋白水解酶使细胞崩溃，导致BBB和NCU的损伤。在这通路中B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等抗凋亡蛋白、凋亡抑制因子以及JNK/p38MAPK信号通路参与了线粒体介导细胞凋亡的调控[18]。

2.1 花生四烯酸代谢通路

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是人体内心脑血管活性物质的前体，其代谢产物与脑血管病的发病密切相关[5]。AA的细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)代谢通路是近年研究的热点[6]。AA在CYP羟化酶作用下生成羟基二十碳四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acid，HETEs）,在CYP表氧化酶作用下生成环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EETs），EETs再经过可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase,sEH）作用下生成生物活性较弱的二羟基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid，DHETs)。HETEs具有强力的脑血管收缩作用和促动脉粥样硬化作用。而EETs具有扩血管、调节离子通道、抗动脉粥样硬化等多种生物学功能，对心脑血管具有保护作用。近期临床研究发现，AA的CYP代谢通路代谢产物（EETs和HETEs）水平与急性缺血性卒中后神经功能恶化密切相关[7，8]，提示它们在脑缺血性损伤中可能发挥重要作用。可溶性环氧化物水解酶（sEH）是调控EETs的关键限速酶。外周血EETs降低不仅与缺血性卒中后神经功能恶化密切相关，还与脑梗死患者颈动脉狭窄程度和斑块不稳定密切相关，并受编码sEH基因（epoxide hydrolase 2，EPHX2）的调控[8，9,10,11]。实验研究也表明[12]，EPHX2基因敲除可增加动脉中动脉阻塞模型大鼠脑血流量，减少梗死体积，对脑缺血具有保护作用，sEH被认为是缺血性卒中防治的新靶点。1-三氟甲氧基苯基-3(1-丙酰哌啶-4-基)脲[1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionyl-piperidin-4-yl)urea,TPPU]是2012年由加利福尼亚大学兽医学院分子生物科学中心Bruce教授等合成的一种新型sEH抑制剂[13]。TPPU分子量为359.3，容易透过血脑屏障与中枢神经系统的sEH结合，抑制sEH活性。猴体内药代动力学表明[14]，与传统sEH抑制剂相比TPPU表观分布容积和浓度-时间曲线下面积大，生物利用度高，半衰期长，每日1次即能够维持有效血药浓度，可逆、非竞争性抑制sEH电流，解离速度快，不会明显蓄积而影响正常的神经突触传导,动物耐受性好。TPPU在多种动物模型中显示其在抗炎和心、肾保护方面均优于传统sEH抑制剂[13]。心脏动物模型研究也表明[15]，TPPU可预防心肌梗死后心肌纤维化，具有抗凋亡、抗氧化、保护线粒体等多种功能。

2.2 sEH 抑制剂对脑缺血保护的研究历程

针对sEH的神经保护是近年关注的热点，虽然EPHX2基因敲除对实验性脑缺血有保护作用，但EPHX2基因敲除要用于临床预防和治疗缺血性卒中还相当遥远，因此sEH抑制剂研发倍受关注。2005年将sEH抑制剂12-(3-金刚烷-1-基脲基)-十二烷酸 [12-(3-adamantan-1-yl-ureido) dodecanoic acid，AUDA]应用在脑缺血神经保护实验研究中，证实其对实验性脑缺血有保护作用[17]。2007年又证实了另一种sEH抑制剂转-4[4-(3-金刚烷-1-基脲基)-环己氧基]-苯甲酸[trans-4-[4-(3-adamantan-1-ylureido)-cyclohexyloxy]-bensoic acid, t-AUCB]能够改善脑血流，对实验性脑缺血有保护作用。AUDA和t-AUCB通过抗凋亡、抗氧化、抗炎、抑制[Ca2+]内流、线粒体保护、拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-Methyl-D-Aspartate Receptor, NMDAR)介导的兴奋毒性等多种机制发挥脑保护作用[18]。但这两种传统sEH抑制剂从胃肠道吸收差，生物利用度低，要达到有效血药浓度所用的药物剂量必须够大，药物易在体内蓄积，副作用较大，动物耐受性差，同时发现这些传统的sEH抑制剂半衰期短，体内血药浓度不稳定，这些原因导致传统sEH抑制剂临床转化的失败。

3 TPPU 对脑缺血保护的研究现状

TPPU是2012年由加利福尼亚大学兽医学院分子生物科学中心Bruce教授等合成的一种新型sEH抑制剂，分子量小，容易透过血脑屏障，与中枢神经系统的sEH结合，抑制sEH活性[16]。TPPU口服生物利用度高，半衰期长，动物耐受性好[19]。是一种非常有希望转化到临床上使用的新型神经保护剂。TPPU在多种炎症动物模型中显示其在抗炎和心、肾保护方面均优于传统sEH抑制剂[13]。心脏动脉模型研究表明[15]，TPPU可预防心肌梗死后心肌纤维化，通过抗凋亡、抗氧化、保护线粒体等多种功能发挥心肌保护作用。

4 总结

目前，TPPU对于脑缺血保护的具体机制尚未研究清楚，需更多的基础研究进行证实。相关通路一旦研究透彻，相信会给脑卒中治疗带来新的曙光。