毛竹HB转录因子调控木质素的生物合成

徐秀荣 高志民

(国际竹藤中心 北京 100102)

同源异型盒(Homeobox，HB)基因几乎在所有的真核生物中广泛存在，最初是通过果蝇的一个体细胞突变体和同源突变体细胞杂交而获得的，它参与调控动物体细胞的位置、形状和数量，该基因家族在动物中被分为11个亚类。随后，不断从植物和真菌等进化距离较远的物种中分离出HB基因的同源基因，它们都有一个由60个氨基酸组成的保守DNA结合域，被称为同源域(homeodomain, HD)，是该转录因子家族的特征结构域。HD特有的三维结构包含3个螺旋，其中第2和第3个螺旋形成一个螺旋-转角-螺旋基序。植物中有许多HB基因编码的转录因子，他们能够与靶基因的顺式调控区结合，在植物生长发育的各生物学过程中发挥调控作用。在植物进化过程中，HB基因分化形成了14个不同的亚类，即BEL、DDT、HD-ZIP I～HD-ZIP IV、KNOX、LD、NDX、PHD、PINTOX、PLINC、SAWADEE和WOX，他们分别具有保守的内含子—外显子结构和各自独特的特征结构域。

毛竹(Phyllostachysedulis)属于禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)，具有生长速度快，材性好的特点，毛竹在1个半月内可长高20 m左右，是木材的良好替代品。随着毛竹基因组和基因组数据库的公布，加速了在全基因组水平上的基因鉴定工作，如IQD、SBP-like、TCP、Heat shock和MYB等基因家族的全基因组分析已先后被报道。尽管已在水稻、葡萄、胡萝卜等多种植物中广泛开展了HB基因家族的鉴定和功能分析，但对毛竹中HB基因家族的情况及其与木质化相关的功能尚缺乏全面的了解。因此，本研究在全面分析毛竹中HB基因家族成员的分子特征、基因结构、保守结构域、进化关系的基础上，研究了与木质素合成相关的HB蛋白之间的互作，及其靶基因在木质化过程中的表达变化，为深入研究HB基因参与调控木质素生物合成的功能，进而揭示竹子木质化的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 毛竹HB基因的鉴定

从TAIR 10.0 (https://www.arabidopsis.org/)和RGAP 7.0 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据库中分别下载拟南芥和水稻的HB序列，作为种子序列，通过BLAST检索在毛竹基因组数据库中获取同源基因序列。然后通过序列比对、保守结构域等分析，剔除冗余序列和保守结构域不完整的序列，保留具有完整HD结构域的序列，并进行下一步研究分析。

1.2 序列分析、基因结构和进化分析

通过Eapasy (http://www.expasy.org/)在线分析毛竹HB家族成员的蛋白质分子量、等电点等基本理化性质，利用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析毛竹HB家族成员的基因结构，利用MEME (http://meme-suite.org)在线软件对毛竹HB序列的保守元件进行预测，使用MEGA 7.0软件对毛竹、拟南芥和水稻的HB序列进行比对，并构建系统进化树。

1.3 功能预测、共表达网络分析和下游靶基因的预测

从PLAZA 4.0数据库(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)获取毛竹HB蛋白的功能注释。利用BambooNET数据库(http://bioinformatics.cau.edu.cn/bamboo/)对毛竹HB基因家族进行共表达分析。同时，从毛竹基因组数据库中获取木质素合成途径中关键基因PAL、4CL、C3H、C4H、HCT、CCR、CCoAOMT、CAD、F5H、COMT和LAC等的启动子序列，并分析其是否存在与HB转录因子结合的特殊DNA结合位点。

1.4 基于转录组数据的组织特异性表达分析

为了探究毛竹HB基因的组织表达特异性，从欧洲分子生物学实验室数据库中下载毛竹叶、早期花序、晚期花序、地下茎、根、20 cm和50 cm高笋的转录组数据(ERP001341)；以毛竹HB基因的RPKM值表示基因的表达丰度。为方便统计，对每个表达数值取以2为底数的对数(log2)，经均一化后，使用Matrix2png软件绘制基因表达热图。

1.5 毛竹实验材料

2018年4月份，在江西省南昌市野外毛竹林中，选择生长良好，基部直径相近的竹笋为候选材料，分别采集不同发育阶段竹笋(笋高0.2、1.0、3.0和6.7 m)基部为样品。此外，12月份，用刀切断竹笋基部“螺丝钉”处的方法挖取毛竹冬笋，选取无病虫害、无机械损伤、笋体一致的竹笋为材料。将其置于恒温恒湿室中，任其自然老化，然后在放置0、3、6、12 d时，分别取其基部为样品。每个样品至少3次重复，样品经液氮处理后，存储于-80 ℃冰箱中，用于RNA提取等。另外，取相同样品固定在FAA中保存于4 ℃冰箱，用于树脂切片。

1.6 cDNA合成及qRT-PCR分析

使用Takara公司植物总RNA提取试剂盒提取毛竹样本总RNA，在质量和浓度检测合格后，利用Promega公司反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，备用。使用Primer 5设计定量PCR引物，qRT-PCR反应在qTower荧光定量PCR仪进行，反应体系(10.0 μL)如下：2× SYBR Ⅱ Green 1 Master 5.0 μL；正向和反向引物各0.2 μL (10 μM)；cDNA 0.8 μL；H2O 4.0 μL。扩增程序：95 ℃ 6 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，40个循环。以PeNTB为内参，采用2-ΔΔCt法分析基因的相对表达量。qRT-PCR实验进行3次生物学重复。

1.7 木质素含量测定和组织观察

木质素含量测定：将待测样本、烘干、磨粉，过40目筛，精确称取0.1 g，然后参照木质素含量测定试剂盒说明书进行测定。木质素含量变化的组织化学观察：将FAA固定液中的毛竹竹笋样品进行包埋处理，用震荡切片机进行切片，厚度为20 μm，用0.01%的甲苯胺蓝对展片的切片于80 ℃染色3 min，并拍照观察。

1.8 酵母双杂交

在共表达分析的基础上，选择蛋白-蛋白相互作用(PPI)预测的核心HB，先进行转录激活活性分析，将基因构建到酵母表达载体pGBKT7，分别涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-GAL培养基用于观察转录自激活活性，同时以pGBKT7-53 + pGADT7-T和pGBKT7分别做阳性和阴性对照。将无自激活活性的HB基因分别构建到pGBKT7和pGADT7载体上，并将重组质粒共转到酵母菌株AH109，然后涂布在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-GAL培养基上，筛选共表达的阳性克隆。

2 结果和分析

2.1 PeHBs基因的鉴定与分析

经分析比对，在毛竹基因组中共获得了115个具典型HD结构域的HB家族成员，依次命名为PeHB001～PeHB115。基本理化性质分析结果显示，PeHBs基因编码的蛋白序列差异较大，预测蛋白的长度为197～542 aa；分子量为18.5～58.8 kDa；理论等电点pI介于4.85～9.47。亚细胞定位预测除PeHB043、PeHB060和PeHB080分别定位在线粒体、胞外和质膜，其余112个PeHBs均定位在细胞核上。

序列比对结果表明，115个PeHBs共分为13个亚类 (BEL、DDT、HD-ZIP I～HD-ZI IV、KNOX、NDX、PHD、PINTOX、PLINC、SAWADEE、WOX)，亚类之间序列保守性不高，但每个亚类内部成员之间保守性较高。对毛竹(115)、拟南芥(107)和水稻(107)中共获得的329个HB氨基酸序列进行系统发育进化分析表明，329个HB共分为14个亚类。多数亚类均包含毛竹、拟南芥和水稻中的成员，毛竹在各亚类(BEL、DDT、HD-ZIP I～HD-ZI IV、KNOX、PHD、PLINC和 SAWADEE)中的成员数量与拟南芥和水稻中的相近，表明这些亚类的成员在谱系分化之前都有一个共同的祖先。然而，在WOX亚类中发现有拟南芥成员16个，水稻成员19个，而毛竹成员只有5个。此外，在LD亚类中没有发现毛竹的成员。

2.2 基因结构和保守结构域分析

基因结构分析显示，PeHBs不同成员间存在明显的多样性。在115个成员中共发现了20种不同的外显子-内含子分布模式，PeHBs的内含子数量在0～36之间。PLINC、HD-ZIP I和HD-ZIP II亚类的大多数成员内含子数量较少，基因的长度较短，而DDT和HD-ZIP III亚类的成员内含子数量较多，基因长度较长。NDX亚类中PeHB078的基因结构最复杂，其序列长度为22 071 bp，包含内含子的数量为36个。此外，同一亚类的大多数成员都有相似的基因结构，但也有少数成员例外。例如SAWADEE亚类的3个成员，PeHB094的序列长度为1429 bp，但仅包含一个内含子，而PeHB043和PeHB080的序列长度分别为3 651 bp和16 491 bp，包含内含子的数量分别为8个和31个，表明他们的基因结构更加多样化。

此外，对PeHBs编码的蛋白进行保守基序分析，共发现20个保守基序。进一步分析发现，每个保守基序的氨基酸残基数量不同，其中最短的motif 2中包含15个氨基酸，最长的有50个氨基酸，存在于8个motif (motif 3、motif 6、motif 7、motif 10、motif 12、motif 14、motif 18、motif 20)中。其中，motif 1 (GLTPRQVSNWFQNRRARLKKK)含有高度保守的氨基酸(W10和F11)，经鉴定motif 1属于HD保守结构域，存在于95个PeHBs中，占基因总数的83%。Motif 13、motif 15和motif 16分别为ZIP III、BEL和KNOX亚类所特有。

2.3 PeHBs组织特异性表达分析

利用转录组数据，对PeHBs在毛竹不同组织中的表达模式进行了分析。结果表明，除PeHB017外，其它114个PeHBs至少在1个组织中表达。此外，90个PeHBs在所有组织中均有表达，但在不同组织间的表达丰度存在明显差异。例如，BEL亚类的大部分成员在毛竹叶片和花序中表达量较高，而在其他4个组织中表达量相对较低；PLINC亚类成员在毛竹竹笋中相对表达量比其它组织中的高；而HD-ZIP IV亚类成员在根中的表达水平明显低于其他组织；HD-ZIP III、SAWADEE和NDX亚类中的一些成员，在所有组织中均有较高的表达。此外，同一亚类成员间的表达模式存在差异，例如KNOX亚类中，PeHB054、PeHB057和PeHB084在叶片中高表达，而PeHB051、PeHB058、PeHB074和PeHB100则较低。

2.4 基于GO分析的PeHBs的功能预测

通过GO富集，对PeHBs参与的主要生物学功能进行了分析。结果表明，在115个PeHBs中具有功能注释的基因为113个，分别参与了生物学过程、分子功能和细胞成分3大功能，其中有超过65%的PeHBs富集在生物过程当中。此外，“与DNA结合的特异性序列”(GO:0043565)，“具有转录因子活性与DNA结合的特异性序列”(GO:0003700)和“与蛋白结合”的(GO:0005515)是在分子功能中最常见的注释条目，表明这些PeHBs编码的转录因子具有很强的转录激活活性，并能够与特定的DNA结合来行使功能。在所有分子功能中，调控“木质部发育”(GO:0010089)和“木质部与韧皮部模式形成”(GO:0010051)的PeHBs基因数量为19个，这些基因用于共表达分析和表达模式分析。

2.5 PeHBs共表达网络及PPI预测

为了构建与木质化相关的基因网络，选择了19个标注为GO:0010089和GO:0010051的PeHBs，根据转录组数据生成共表达网络图。结果显示，19个PeHBs中有10个具有共表达相关性，其中6对基因相互间存在正向共表达，包括PeHB007和PeHB027、PeHB017和PeHB057、PeHB031和PeHB109、PeHB042和PeHB109、PeHB074和PeHB031、PeHB074和PeHB109；唯一的负向共表达基因对是PeHB005和PeHB095。这表明，共表达的PeHBs可能共同参与调控毛竹细胞壁的木质化。

为了研究毛竹中19个PeHBs与其它蛋白的相互作用，构建了一个PPI网络。节点代表PeHBs和其它转录因子，边缘是2个蛋白的相互作用。根据节点之间的连接，可以将18个节点明确地分为2组。在一组中，18个节点中有15个连接，其中包含8个PeHBs(4个KNOX类成员和4个BEL类成员)和3个KNOX类成员是与其他PeHBs和TFs(如MYB、bHLH、OVATE等)相互作用的核心蛋白。另一组仅包含3个节点和2条边，表示PeHB005与PeMYB1和PeMYB16相互作用。研究表明，水稻中MYB、bHLH和OVATE与木质素合成有关，这意味着毛竹中木质素合成的调控是一个包含多种转录因子的复杂网络。

2.6 PeHBs转录活性及互作关系验证

选取PPI网络中KNOX亚类的4个成员(PeHB057、PeHB058、PeHB072和PeHB100)，克隆其完整的ORF区域并测序确认，然后构建到pGBKT7载体中。将重组质粒转化到AH109酵母细胞中，而后在缺陷型培养基上进行了检测。结果表明，阳性对照能够在“一缺”和“三缺”的培养基上生长，并在“三缺”培养基中菌落变蓝，而KNOX亚类的4个成员转化到pGBKT7后在“三缺”培养基上不变蓝，表明KNOX亚类的4个成员没有转录自激活活性。

为了研究不同PeHBs之间的PPI，选取预测网络中的PeHB037 (BEL亚类)和PeHB057 (KNOX亚类)，使用酵母双杂交系统进行验证。结果表明，AD-PeHB037和BD-PeHB057共转到AH109酵母细胞后在“二缺”培养基上生长良好，在加了X-α-GAL的“四缺”培养基SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-GAL上与阳性对照表现一致，均变蓝色。由此表明，PeHB037与PeHB057在酵母细胞中存在蛋白互作关系，在毛竹中具有调控功能。

2.7 与木质素生物合成相关的PeHBs的表达模式分析

为了解19个与次生细胞壁相关的PeHBs的功能，利用qRT-PCR对毛竹不同高度笋中及冬笋采后自然老化过程中PeHBs的表达模式进行了分析。结果表明，随着竹笋高度的增加大多数PeHBs的表达量随之增加。BEL和KNOX亚类的所有成员在6.7 m高度笋的表达量高于0.2 m笋中的表达量，尤其是PeHB042、PeHB109、PeHB017和PeHB057分别显著上调147、683、321和465倍。WOX亚类中的PeHB019和PeHB070表现出相似的趋势，都是先增加后减少，最终在6.7 m笋中的表达量达到最大值。ZIP亚类中除了PeHB005是下调之外，其他所有成员的表达趋势均为上调。另外研究发现，19个PeHBs在25 ℃贮藏的冬笋中的表达模式与不同高度笋中的类似，PeHB005是唯一显著下调的基因。这些PeHBs表达变化以及不同PeHBs之间的表达量差异，表明他们对竹子的木质素生物合成调控作用存在着一定的差异，从而不同程度地影响其木质化进程。

2.8 毛竹笋在不同储藏时间下的木质化分析

竹笋是竹子未成熟的茎，笋在随着生长高度的增加以及储存时间延长的过程中均会发生木质化。木质化过程的主要特征是木质素在细胞壁的沉积，这已在不同高度的笋的实验研究中得到证实。因此，本实验将收集到的25 ℃贮藏条件下的冬笋，分别在储存0、3、6、12 d时进行木质素变化的分析。组织化学染色结果显示，随着贮藏天数的增加，冬笋维管束的染色面积和着色深度逐渐增大；同时，冬笋中木质素的含量也有所增加。贮藏12 d时木质素含量为22.38%，明显高于对照(9.38%)(P< 0.05)。木质素的增加与大多数PeHBs (19个PeHBs中的14个)在冬笋中的表达量增加趋势是一致的。这些结果表明，冬笋在储藏过程中木质化程度不断加深，而PeHBs基因表达变化恰好说明了他们可能以不同程度参与调节笋木质素的生物合成调控，进而影响木质化的过程。

2.9 与木质素合成相关的结构基因在竹笋木质化过程中的表达

对木质素生物合成相关的关键基因启动子序列的分析发现，在Pe4CL(PH01000809G0020)、PeC3H(PH01001724G0360)、PeCCR(PH01001334G0240)和PeCOMT(PH01001283G0360)4个基因的启动子均存在KNOX的DNA结合位点(TGACAGC)，表明他们可能是受KNOX的转录调控。qRT-PCR结果显示，Pe4CL、PeC3H、PeCCR、PeCOMT的表达量随着木质化程度的增加而明显增加。特别是PeCOMT在6.7 m高笋的表达量比0.2 m高时显著增加了53倍，而在冬笋储藏12 d时的表达量是鲜笋的122倍。在不同高度笋中4个木质素合成基因与5个KNOX基因的表达呈正相关；在竹笋储存过程中与3个PeHBs (PeHB017、PeHB057和PeHB074)的表达呈正相关，这为PeHBs通过调节木质素生物合成基因来参与木质化过程的调控提供了有力的证据。

3 讨论

HB基因在植物中普遍存在，在调节细胞分化、胚芽分生组织形成、胚胎模式形成、维管发育、花器官发生、果实成熟等方面发挥着重要作用。因此，开展毛竹HB基因的鉴定与表达研究，将有助于揭示其在毛竹生长发育中的调控功能。

3.1 基因结构和保守结构域可能与基因功能相关

在毛竹中有94个PeHBs (占总数的85%)的内含子数量少于10个，只有21个PeHBs的内含子数量多于10个。在同一亚类中内含子的数量是相近的。例如，ZIP I类的成员有1个或2个内含子，而ZIP III类的成员比ZIP I、II和IV类包含更多的内含子，但他们是相对保守的，与葡萄中内含子的情况类似。一般来说，外显子或内含子的得失可能是造成功能差异的主要原因，会使基因的功能多样化。在115个PeHBs中发现了20个高度保守的基序，每个亚类当中不同的基序是保守的并且分布也是相似的。此外，这些基序在进化过程中高度保守，暗示可能与其功能保守性有关。

3.2 PeHBs在不同组织中的表达模式具有多样性

根据PeHBs在毛竹不同组织和不同发育阶段的表达差异，发现他们具有不同的组织表达特异性。例如，HD-ZIP III、SAWADEE、NDX等亚类的成员在所有组织中均有高表达，表明他们可能参与了多种生物学过程，在毛竹的生长发育过程中发挥重要作用。而PeHB017在所有组织中表达水平都非常低，这表明他可能参与了其他的生物学过程。PHD和HD-ZIP IV亚类中部分PeHBs在根中的表达水平明显低于其他组织，表明他们参与根生长发育的作用较小。BEL亚类的大部分成员在叶片和花序中表达量较高，但在其他4种组织尤其是笋中较低。此外，PLINC亚类的PeHBs在竹笋中表达占主导地位，在其他组织中相对较低。

3.3 19个PeHBs在毛竹笋木质化过程中起重要作用

在自然条件下，随着笋生长高度的增加，以及在室温条件下随着贮藏时间的延长，竹笋的木质化程度都是增加的。除PeHB005外，其余18个PeHBs的表达量随笋高度增加和储存时间延长最后均呈现上调的趋势。然而，上调的PeHBs表现出不同的表达模式。例如8个PeHBs的表达丰度呈现不断上升的模式，说明这些基因在木质化过程中发挥着正调控作用。同时，5个上调基因表现出先升高后下降的趋势，表达量的最大值分别出现在1.0 m或3.0 m高度笋和储存3 d或6 d后的冬笋中。PeHB005是贮藏期间以及不同高度笋木质化过程中唯一下调的基因。这些结果表明，木质化过程是一个与由多个PeHBs有关的复杂的调控网络。

3.4 PeHBs组成木质化调控网络

植物木质化是一个与细胞分化和发育相关，并且由许多转录调控因子和功能基因共同表达驱动的复杂的生物学过程。有研究表明，KNAT7与BLH6相互作用，在次生细胞壁形成中起抑制作用。在本研究中，KNOX类(PeHB074)和BEL类中的2个成员(PeHB031、PeHB109)在互作网络中呈正向共表达，这与他们在笋木质化过程中表达结果相一致。本研究在Pe4CL、PeC3H、PeCCR和PeCOMT的启动子中均发现了KNOX的结合位点，并且3个KNOXs与这些木质素合成基因呈现正向共表达关系。根据PeHBs构成的共表达网络、蛋白间互作关系以及对下游结构基因的调控作用，表明毛竹木质化过程是一个复杂的调控网络。

4 结论

从毛竹中鉴定出115个PeHBs，分为13个亚类。有19个PeHBs被预测与木质素生物合成相关，其中10个PeHBs具有共表达相关性。随着木质化程度增加，在不断生长的笋和室温贮藏的笋中19个PeHBs的表达模式是相似的，其中3个KNOX亚类的PeHBs与4个木质素合成基因(Pe4CL、PeC3H、PeCCR和PeCOMT)的表达呈正相关。PPI预测KNOX亚类的3个PeHBs是与其他转录因子相互作用的枢纽蛋白，PeHB037与PeHB057在酵母中互作验证了这一点。由此表明，PeHBs参与毛竹木质素生物合成，通过形成一个多层次的调控网络影响其木质化过程。

原 文 出 处

Xu X R, Lou Y F, Yang K B, Shan X M, Zhu C L, Gao Z M. Identification of homeobox genes associated with lignification and their expression patterns in bamboo shoots. Biomolecules. 2019. 9, 862. DOI: 10.3390/biom9120862.