肺炎链球菌神经氨酸酶A的研究进展

殷庭萱，李艺然，刘志伊，徐 岩，贾文宁，刘金辉

(南昌大学a.玛丽女王学院2017级； b.医学院微生物学教研室，南昌 330006)

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)是常见的呼吸道病原体，广泛地存在于口腔或鼻咽部，约有5%～10%的健康成人和20%～40%的健康儿童携带此菌[1]。在人体中，S.pneumoniae感染所致疾病的种类与严重程度与其定植能力和侵袭部位有关，S.pneumoniae可以导致鼻窦炎、中耳炎和侵袭性肺炎。在特定的病理情况下，细菌可以侵入血液导致菌血症，并最终穿透血脑屏障导致侵袭性脑膜炎。大多数感染和死亡病例见于机体免疫力较低的65岁以上老年人和5岁以下儿童[2]。采用S.pneumoniae感染动物模型进行的研究结果表明，其毒力因子神经氨酸酶A(neuraminidase A,NanA)参与S.pneumoniae的侵袭与扩散，在S.pneumoniae所致的多种侵袭性疾病中起重要作用[3]。本文对NanA在感染中的毒力机制进行简要综述。

1 肺炎链球菌毒力因子简介

S.pneumoniae感染与多种毒力因子的表达有关，包括荚膜多糖、菌毛、S.pneumoniae溶素蛋白及多种蛋白酶类等分子。荚膜多糖不仅是细菌产生毒力的必需条件，帮助其抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用，有利于细菌在宿主体内大量繁殖，还具有抗原性，是S.pneumoniae分型的重要依据[4]。菌毛是S.pneumoniae胞外菌体结构之一，帮助细菌黏附到宿主细胞等各种固体物质的表面，提高细菌侵袭能力并参与生物膜形成。溶血素(pneumolysin,Ply)是细菌胞内蛋白，经自溶酶作用释放后可以通过形成跨膜孔溶解真核细胞，并激活补体的经典途径，刺激炎症细胞因子产生，与S.pneumoniae感染导致的高死亡率及急性致死性肺炎和心肌损伤密切相关[5]。此外，S.pneumoniae表面蛋白(pneumococcal surface protein A,PspA)、S.pneumoniae表面黏附素A(pneumococcal surface adhensin A,PsaA)等表面蛋白也都被证实在S.pneumoniae致病过程中发挥重要作用。S.pneumoniae产生多种糖水解酶，通过对宿主细胞膜糖复合物的脱糖基化来促进细菌的黏附和定植，降解产物糖基还可作为细菌繁殖的营养物质。在这些糖水解酶中，神经氨酸酶致病性最强，具有降解唾液酸的酶活性，可以分解宿主细胞表面或体液中的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖复合物末端的唾液酸残基。

2 神经氨酸酶分子结构特征

神经氨酸酶是S.pneumoniae表达的一种重要毒力因子，参与该菌致病过程。S.pneumoniae的基因组可编码3种同源神经氨酸酶：NanA、NanB和NanC，三者在临床分离株的基因频率分别是100%、97%和36%～51%[6]，蛋白分子量依次为114、77、82 kD[2]。三者之中NanA活性最强，活性中心保守性最高，且在所有S.pneumoniae感染的临床分离株中广泛表达，说明S.pneumoniae的感染与NanA的毒力机制密切相关。NanA的编码基因长约3108 bp，其蛋白产物约含1035 aa，可分为N端信号肽(aa1-120)、N端凝集素域(aa121-305)、催化域(aa326-437、aa532-822)、C端膜结合域(aa823-1035)等多个结构域[7]。各个结构域的功能不同，凝集素域又称为碳水化合物结合组件(carbohydrate-binding module,CBM40)，可特异性识别聚糖末端唾液酸(sialic acids)，并引导NanA酶活性关键基团催化域与之结合。这一区域已被证实在细菌对人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,hBMECs)的黏附和侵袭方面起重要作用，因此其可能是诱发细菌性脑膜炎的关键因子[8]。

NanA蛋白催化域呈现神经氨酸酶家族经典的六叶β螺旋桨样折叠结构，活性中心含有对底物唾液酸进行化学转化至关重要的氨基酸残基，并包含一段功能未知的插入域(insertion domain)。C端膜结合域包含一段LPETG基序(motif)，其在S.pneumoniae转肽酶A(sortase A,SrtA)作用下将NanA锚定在细胞壁表面，而NanB和NanC因缺失该序列而直接分泌到胞外，进入机体组织液[9]。

在NanB和NanC蛋白结构中，凝集素域和催化域在多种域间相互作用下形成坚硬球状体直接相连，而在NanA中2个结构域彼此分离，由一段长度为16 aa的灵活连接体隔开，因而具有良好的柔韧性[10]。NanA具有广泛的底物作用范围，可大量识别、分解α-2,3键连接的唾液酸、α-2,6键连接的唾液酸和α-2,8键连接的唾液酸等3种底物，而NanB和NanC主要分解α-2,3键连接的唾液酸[2]。此外，生物信息学分析显示NanA蛋白表面以负性电荷为主，活性中心则以正性电荷为主，这种特殊的电荷分布也能增强其对呼吸道上皮细胞的黏附和对天然底物唾液酸的特异性结合能力[11]。

3 NanA致病机制

3.1 促进细菌黏附与定植

唾液酸也称乙酰基神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)，是一种细胞保护因子，广泛分布于宿主胞膜表面，具有多种重要的细胞生物学功能。成功定植于呼吸道黏膜上皮细胞是S.pneumoniae的感染过程的第一步，而NanA对唾液酸的切割降解是帮助S.pneumoniae定植的重要分子机制。因为宿主上皮细胞表面所含的多糖、糖蛋白、低聚糖和糖脂等糖复合物末端多为唾液酸残基。尤其是唾液酸化的糖蛋白如黏蛋白(mucins)在呼吸道黏膜表面表达水平较高，在黏膜表面形成了高粘稠度的粘液屏障。NanA对这些表面分子的唾液酸残基裂解破坏了它们所形成的粘液分子屏障，使细菌得以定植上皮细胞，进而繁殖扩散到更深层的组织部位[12]。

S.pneumoniae对真核细胞的黏附过程分为两步，首先与宿主细胞表面糖复合物进行较松散的相互作用，后与细菌侵袭相关的宿主受体进行更紧密、特异性更高的结合。NanA在第一步发挥作用：当细菌跨过粘液素屏障接触到上皮细胞后，NanA裂解宿主细胞表面寡糖，暴露出下方的隐性受体，增强细菌对组织的黏附。NanA缺失的S.pneumoniae变异株在体外与在南美栗鼠气管组织结合的能力较野生型下降，在体内经鼻感染后诱发下呼吸道感染的能力也减弱[13]。

感染组织后，S.pneumoniae需要通过糖类发酵代谢产生的能量来维持活性。尽管呼吸道表面的游离糖浓度有限，S.pneumoniae可以利用包括神经氨酸酶在内的一系列糖苷酶对宿主糖基化分子的水解作用来满足其营养需求。其中，裂解并移除末端唾液酸是细菌对宿主糖复合物进行连续降解的第一步也是必要的一步，因此神经氨酸酶被认为是S.pneumoniae最关键的糖水解酶[14]。此外，经酶作用释放的游离唾液酸在体内外均可作为扩散信号，促进S.pneumoniae在体内转移、繁殖，并可以诱导细菌经鼻嗅球侵袭中枢神经系统引发非血源性脑膜炎[15]。

3.2 促进生物膜形成

生物膜是一种包裹在细胞外基质中的细菌的表面附着群落，形成生物膜是S.pneumoniae在上皮组织定植与生存的重要过程之一，在鼻窦炎患者的鼻中隔活检标本上、实验感染小鼠的鼻中隔上皮以及体外培养的呼吸上皮细胞上，都能够检测到S.pneumoniae生物膜的存在[16]。当S.pneumoniae在生物膜环境中生长时，NanA表达水平上调提示其在生物膜形成过程中发挥重要作用[17]，其作用主要是促进细菌微菌落的形成，及以微菌落为基本单位形成成熟的生物膜。而NanA缺失的S.pneumoniae菌株形成生物膜能力显著下降[18]。PARKER等[19]的实验结果显示，高浓度的乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NANA)通过与底物竞争拮抗NanA活性，最终导致S.pneumoniae生物膜形成量显著下降。这些研究表明NanA在S.pneumoniae生物膜的形成过程起重要作用。

NanA促进S.pneumoniae生物膜形成的机制是复杂的，目前认为其作用可能与酶活性有关，一方面通过降解宿主细胞表面糖基复合物，使游离唾液酸大量释放促进生物膜形成[20]，另一方面通过暴露下层半乳糖残基调节S.pneumoniae对碳源的摄取和利用促进生物膜形成[18]。WREN等[21]通过实验证实NanA在生物膜形成过程中也发挥着与酶活性无关的独特作用。生物膜给予细菌群体共享有利遗传信息的机会，使之对抗菌肽具有更高的抵抗力，使得S.pneumoniae从最初的无症状定植逐步演化为具有诱发侵袭性疾病的潜能。

3.3 在S.pneumoniae侵袭性感染中的作用

NanA参与S.pneumoniae所致的死亡率普遍较高的侵袭性疾病(invasive pneumococcal disease,IPD)发生与进展过程，如败血症、脑膜炎和非典型溶血性尿毒综合征(pneumococcal hemolytic uremic syndrome,pHUS)。S.pneumoniae通过多种途径进入血流，包括淋巴管途径、上皮细胞和内皮细胞的细胞损伤途径以及内皮细胞的直接侵袭途径。进入血液后，NanA通过对人体血清成分的脱糖基化来干扰补体因子C3在细菌表面的沉积[2]，减少中性粒细胞介导的调理吞噬作用，有利于细菌逃避机体免疫防御而在血液中繁殖扩散。另一方面，NanA从细胞膜复合糖结构中去除唾液酸将减少补体调节因子H与自身细胞表面的结合[22]。H因子作为补体激活途径之替代途径中的关键调节因子，抑制补体反应激活因子C3b在生物表面的沉积，保护自身细胞不受攻膜复合体(membrane attack complex,MAC)的破坏。因此，当H因子与红细胞、内皮细胞以及血小板上唾液酸的相互作用减少时，缺乏调节的补体系统被激活可能导致全血溶血和血小板聚集，造成严重的系统性疾病。此外，NanA对某些关键免疫因子的脱糖基化作用将削弱其在免疫反应抵御病原体侵袭中的调控能力，有利于S.pneumoniae在体内生存繁殖。

血源细菌沿血管进入脑部，附着并穿透以单层hBMECs为主的血脑屏障，是脑膜炎发生机制中的首要过程。NanA缺失型S.pneumoniae对hBMECs的黏附、侵袭的能力较野生型下降约90%[23]，表明NanA在引发脑膜炎中发挥关键作用，细菌穿透血脑屏障后对神经系统造成的损害则与其它毒力因子协同完成。在内皮细胞上，NanA裂解末端唾液酸，修饰宿主细胞表面糖复合物以暴露亲和力更高的受体，促进细菌粘附并穿透内皮细胞。此外，NanA蛋白N端凝集素结构域能够充分活化内皮细胞，激活趋化因子[如interleukin 8(IL-8)]和中性粒细胞募集，在促进S.pneumoniae对hBMECs的侵袭以及诱发急性脑膜炎的过程中发挥重要且特异的作用[24]。

3.4 在与流感病毒协同感染中的作用

流感爆发或流行期间，肺炎发病率与死亡率过高被认为与S.pneumoniae和流感病毒之间的致死性协同感染有关。研究发现S.pneumoniae的NanA蛋白可以促进流感病毒从宿主细胞表面释放，并在呼吸道组织快速扩散[25]。NanA促流感病毒扩散作用呈浓度依赖性：一定浓度下，可以增强流感病毒的复制能力；大量存在时，病毒的扩散能力和产量反而下降[26]。过量NanA可能通过裂解宿主细胞表面乳糖分子末端唾液酸(SA-α2,3-Gal和SA-α2,6-Gal)，清除病毒受体，干扰病毒对宿主的黏附[27]。

同时表达Nan和S.pneumoniae的NanA是流感病毒和S.pneumoniae2种病原体达到完全协同所必需的。共感染的流感病毒促进S.pneumoniae在鼻腔定植并加重疾病进展这一作用已被证实。为研究S.pneumoniae的NanA在共感染中的致病作用，WREN等[21]采用小鼠模型进行研究，鼻腔定植力与感染力均出现严重受损的S.pneumoniae的NanA缺失突变株在与表达神经氨酸酶的甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)共感染时，S.pneumoniae突变株的定植力与致病力均得以提升，但仍达不到野生S pneumonia的致病水平[21]，即流感病毒的神经氨酸酶不能完全弥补S.pneumoniae缺失的NanA的致病作用，说明2种神经氨酸酶分子的致病机制存在某些未知的差异，它们在2种病原共感染过程中起协同作用，从而加重S.pneumoniae疾病进展。

4 靶向NanA的药物与疫苗的研制

S.pneumoniae作为引发社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)最主要的病原体，相关药物与疫苗的开发一直是研制重点。随着抗生素耐药与人口老龄化的加剧，S.pneumoniae对一些抗生素表现多重耐药，包括青霉素、大环内酯类、喹诺酮类及头孢菌素类，且耐药率逐年上升[27]。有效的S.pneumoniae疫苗很大程度上缓解了耐药危机，现行使用的疫苗以荚膜多糖疫苗(capsular polysaccharide vaccine,PPV)(PPV23)和蛋白质-荚膜多价结合疫苗(protein-capsule multivalent conjugate vaccine，PVC)(PCV7、PCV10、PCV13)为主。多价结合疫苗将荚膜和蛋白载体相结合，激发T细胞参与免疫反应，从而产生更强的免疫原性和持久的免疫保护，显著降低儿童(尤其2岁以下)S.pneumoniae肺炎发病率[28]。但由于细菌持续变异和选择作用，其型别限制和荚膜血清转换等缺点逐渐展现，“第三代疫苗”重组蛋白疫苗因其保守性好、免疫原性强、价格相对低廉等优势得到广泛关注[29]。

相比于传统的血清接种，黏膜免疫是一种很有潜力的新型接种方式，可同时诱导黏膜和全身免疫反应，对主要定植于人类呼吸道黏膜表面的S.pneumoniae引发的肺部疾病提供更特异的保护[30]。有实验[31]证实，用NanA蛋白黏膜免疫小鼠后可诱导高滴度抗体的产生，能有效抵抗致病性S.pneumoniae的感染，抑制其在宿主鼻咽部和肺部的定植，提示NanA或可作为新型疫苗的载体或融合蛋白，具有疫苗研发价值。

以S.pneumoniae的NanA蛋白毒力因子为靶点的新型药物也在不断研制中。从植物中提取的小分子药物β-谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(β-Sitosterol-3-O-glucopyranoside，SOG)可以通过抑制SrtA酶活性阻止NanA在细胞壁上锚定[9]，进而影响NanA在促进细菌于呼吸道上皮黏附和定植中的作用，缓解肺组织病理变化。由于流感病毒神经氨酸酶和NanA结构存在一定的相似性，多种双靶向该相似结构的神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors,NAIs)也在研究与评估之中，这些药物分子通过靶向抑制2种病原体之间的神经氨酸酶的协同作用，降低流感流行期间死亡率和S.pneumoniae二次感染发生率，目前研究发现桂木黄酮(Artocarpin)效果最优，是目前唯一对S.pneumoniae生长和生物膜形成都有抑制作用的NAI[25]。

5 结语

NanA作为S.pneumoniae的一种重要毒力因子，在S.pneumoniae的毒力及疫苗研发方面都起着重要作用。一方面，该蛋白主要在细菌致病的起始阶段发挥作用，以多样化的作用机制参与S.pneumoniae在人体不同部位的感染。另一方面，以NanA为靶点的抗S.pneumoniae药物和新型疫苗的研制为减轻S.pneumoniae感染带来的公共卫生压力提供了新的途径。虽然NanA毒力性质的认识已取得了一定的研究成果，但某些作用机制的结论处于实验模型动物阶段，并且模型动物与人体在组织结构功能上存在较大差异，加之NanA的氨基酸序列和抗原性在不同型别的S.pneumoniae中存在一定变异，因此研究成果最终转化为临床应用仍需进一步仔细验证。