绿茶末中L-茶氨酸的离子交换树脂纯化研究

刘晶晶，陈志元，王 玉，江 丹，李名洁

（劲牌持正堂药业有限公司，湖北黄石 435000）

我国是世界最早开发利用茶叶的国家，在茶叶的生产与消费上位居世界前列[1]。茶叶在生产加工过程中会产生大量的茶末、茶梗等副产品，利用价值不高。随着茶叶深加工行业的发展，茶叶废料得到有效利用，特别是对茶末废料进行提取、分离纯化，可以获得多种生物活性物质，其中L-茶氨酸因其良好的生理功能与药用价值，逐渐成为国内外天然药物开发关注的热点[2]。

L-茶氨酸，又名L-谷氨酸-γ-乙基酰胺，是茶叶中特有的氨基酸，占茶叶干质量的0.5%～3.0%，天然存在的L-茶氨酸均为L型，化学性质稳定[3]，具有降低血压、保护神经细胞、抑制癌细胞、浸润、减肥、改善经期综合症、提高免疫力、防御病毒等作用[4]。研究表明，茶叶中L-茶氨酸的含量与茶叶的品质呈正相关，茶叶中酚氨比值低，有利于茶叶品质[5]。现有的L-茶氨酸获取方式有化学合成法、微生物发酵法、茶叶愈伤组织及细胞培养法、体外酶促合成法等，存在安全性、成本高、技术难点攻克等问题[6-7]。从茶叶中直接提取分离制备获得L-茶氨酸，操作简便，易于实现。L-茶氨酸是两性电解质，使用离子交换树脂通过离子交换反应，可以实现目标物质与杂质的分离[8]。

以绿茶末为原料，在实验室前期确定了提取、大孔吸附除杂工艺的基础上，分别比较了LSI-010（H+），LSI-010（NH4+），001×7（NH4+），D941（OH-）4种类型离子交换树脂对绿茶末L-茶氨酸的纯化效果，并确定了LSI-010（H+）最佳上样pH值和氨水洗脱浓度。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪；AB135-S型分析天平，梅特勒-托利多公司产品；Sepax C18型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷伦科技公司产品；ELGA Option-Q型超纯水系统；水浴锅，上海申生科技有限公司产品。

1.2 试药

绿茶末，购自湖北宜昌；LSI-010型树脂，西安蓝深科技有限公司提供；001×7树脂、D941树脂，西安蓝晓科技有限公司提供；对照品L-茶氨酸（纯度98%，批号DST170621-021），成都德斯特生物技术有限公司提供；乙腈（TEDIA，色谱纯）；盐酸、氨水、氢氧化钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

2 L-茶氨酸检测方法

2.1 对照品储备液的制备

精密称取L-茶氨酸对照品11.78 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即为对照品储备液，L-茶氨酸浓度为230.89 mol/L。

2.2 供试品溶液制备

精密称取绿茶末提取物50.00 mg于10 mL容量瓶，加水超声溶解，定容至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Sepax C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外检测器，检测波长为210 nm；按照表1梯度洗脱，流动相流速0.5 mL/min，柱温30℃。

梯度洗脱见表1，L-茶氨酸对照品HPLC色谱图见图1，绿茶末提取物HPLC色谱图见图2。

表1 梯度洗脱

图1 L-茶氨酸对照品HPLC色谱图

图2 绿茶末提取物HPLC色谱图

2.4 检测方法学研究

2.4.1 线性范围考查

分别精密移取2.1项下对照品储备液2，4，6，8，10 mL于10 mL容量瓶，加水稀释定容，所得L-茶氨酸浓度分别为46.18，92.36，138.53，184.71，230.89 mol/L，0.22 μm滤膜滤过后，作为标准品溶液备用。按照2.3项下所示条件进行色谱分析，以L-茶氨酸标准品溶液浓度为横坐标（X），以L-茶氨酸标准品溶液峰面积为纵坐标（Y），建立标准曲线：Y=9.02×103X-1.81×104，R=0.999 5。

2.4.2 精密度试验

精密称取绿茶末提取物51.31 mg，按照2.2中所示方法制备供试品溶液，在2.3项下进行色谱分析连续进样6次，精密度试验RSD值为0.87%。

2.4.3 稳定性试验

取2.4.2中的供试品溶液，按照2.3中色谱条件下分别于0，40，80，120，240 min时进样分析，得到绿茶末提取物中L-茶氨酸的峰面积，稳定性试验RSD值为0.94%。

2.4.4 重复性试验

精密称取绿茶末提取物50 mg共6份，按照2.2中所示方法制备供试品溶液，按照2.3中条件进行色谱分析，利用建立的标准曲线计算各供试品溶液中L-茶氨酸的含量，重复性试验RSD值为0.94%。

2.4.5 加标回收试验

精密称取绿茶末提取物25 mg共9份，分别加入相当于25 mg提取物中L-茶氨酸含量50%，100%，150%3个梯度的L-茶氨酸对照品溶液各3份，按照2.2中所示方法制备绿茶末提取物供试品溶液作为加标回收试验样品，按照2.3中条件进行色谱分析，利用标准曲线计算L-茶氨酸的含量及回收率。计算所得绿茶末提取物中L-茶氨酸的平均回收率为102.82%，加标回收试验的RSD值为0.02%。

3 离子交换树脂对L-茶氨酸纯化效果的考查

绿茶末经混匀后，分别加入药材量15倍，10倍纯化水，于70℃下提取30 min，提取2次，过滤后，经大孔树脂吸附分离，收集上样流出水洗液，分别考查离子交换树脂类型、上样pH值和氨水洗脱浓度对L-茶氨酸纯化效果的影响。

3.1 不同类型离子交换树脂对L-茶氨酸纯化效果的影响

称取等量绿茶末4份，经过提取、大孔树脂分离后，收集上样流出水洗液，分别经LSI-010（H+），LSI-010（NH4+）、001×7（NH4+）、D941（OH-）树脂交换后，4 BV水洗，弃去水洗液，0.5 mol/L氨水6 BV洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，计算收率，并测定L-茶氨酸的含量。

不同类型离子交换树脂对L-茶氨酸的纯化效果见表2。

3.2 不同上样pH值对L-茶氨酸纯化效果的影响

表2 不同类型离子交换树脂对L-茶氨酸的纯化效果

精密称取等量LSI-010共5份，预处理为H型后滤干水分，4%HCl调节大孔水洗流出液pH值为3.0～3.5，3.5～4.0，4.0～4.5，4.5～5.0，5.0～5.5，加样至离心管中，静态吸附，间歇振荡混匀，测定吸附前后L-茶氨酸浓度，计算L-茶氨酸的吸附率。

式中：C0——吸附前L-茶氨酸的量，mg；

C1——吸附后L-茶氨酸的量，mg。

不同上样pH值对L-茶氨酸的纯化效果见表3。

表3 不同上样pH值对L-茶氨酸的纯化效果

3.3 不同浓度氨水洗脱对L-茶氨酸纯化效果的影响

称取等量LSI-010共5份，预处理为H型后，装柱上样，4 BV水洗，弃去水洗液，分别以6 BV 0.25，0.50，1.00，1.50，2.0 mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，测定提取物中L-茶氨酸含量。

不同浓度氨水洗脱对L-茶氨酸的纯化见表4。

表4 不同浓度氨水洗脱对L-茶氨酸的纯化

4 结论

不同类型离子交换树脂对L-茶氨酸的纯化效果（表2）结果显示，经4种树脂交换后，绿茶末提取物中L-茶氨酸的含量从高到低依次为LSI-010（H+），LSI-010（NH4+），001×7（NH4+），D941（OH-），提取物的收率从高到低依次为D941（OH-），001×7（NH4+），LSI-010（H+），LSI-010（NH4+）；L-茶氨酸是两性电解质，其水溶液显示弱酸性，在此状态下，L-茶氨酸以阳离子形式存在，因而可以与阳离子树脂发生交换。由于不同类型离子交换树脂的交换基团选择性和交联度的差异，其对L-茶氨酸的吸附和交换能力也各不相同；树脂转型后对L-茶氨酸的吸附影响很大，就试验结果而言，H+比NH4+交换能力强[9]。

不同上样pH值对L-茶氨酸纯化效果（表3）结果显示，当pH值在4.5～5.0时，LSI-010（H+）对L-茶氨酸的吸附率较高；降低pH值，相应增加了体系的离子强度，但溶液中的离子与L-茶氨酸存在竞争交换基团。考虑到生产中酸液易于腐蚀管道与设备，调节pH值对L-茶氨酸纯化差异不大，为了避免增加工艺的复杂性，因而LSI-010（H+）上样前无需调节pH值（5.0～5.5）。

不同氨水浓度对L-茶氨酸的纯化效果（表4）结果显示，随着氨水洗脱浓度的增加，提取物中L-茶氨酸的含量先增加后下降，在氨水浓度为0.50 mol/L时，提取物中L-茶氨酸的含量最高；当氨水浓度增加，洗脱液的离子强度也相应增加，L-茶氨酸被释放和置换速度更快，但随之更多的杂质也被洗脱下来。