一种有机稀土及其与植物甾醇复合物的体外应用评估

代发文 黄玉岚 于海娜 姚宏明 许甲平 冯一凡

（1.乐山师范学院，四川乐山614000；2.北京大伟嘉生物技术股份有限公司，北京100085；3.常宁德邦生物科技有限公司，湖南衡阳420500）

稀土具有广谱抑菌作用[1]，用于饲料添加剂具有 促生长、改善饲料报酬等作用[2]。小鼠应用试验发现稀土元素的来源和剂量影响其对采食量和料肉比的调控作用[3]。肉鸡应用试验发现添加低剂量稀土有改善生产性能的作用但对胴体性能和健康度无明显影响[4]。在两个断奶仔猪应用柠檬酸稀土的试验中发现，稀土对料肉比的改善趋势作用不可复制重现，对粪便微生物菌群结构无明显影响[5]。育肥猪应用试验发现，应用稀土可显著改善平均日增重和料肉比，但对血清葡萄糖、蛋白质、胆固醇等无显著影响[6]。上述研究报道表明稀土对动物生产性能的调控并不完全一致，可能与其形式和剂量有关，也有可能与动物生理阶段有关。目前有关稀土作用机制的研究主要集中在抑菌效率[1，7-9]和细胞生长调控[10-12]方面。这种调控效果主要受稀土形式和剂量因素影响，研究发现5种不同稀土元素的水溶性壳聚糖配合物表现出选择性抑菌性能[1]，适宜剂量稀土铈（Ce）显著促进水母细胞细胞生长[11]。稀土促进成骨细胞增殖表现出浓度依赖的两面性，低浓度促生长高浓度抑制生长[12]。

高浓度稀土对菌体生长的抑制作用与其对细胞DNA 氧化损伤作用有关[13]，大鼠细胞培养试验发现，高浓度稀土元素镧（La）抑制线粒体琥珀酸脱氢酶活性表现出细胞毒性[14]。植物甾醇是一种甾类化合物，有提高机体抗氧化能力作用[15]。植物甾醇抗氧化活性的发挥也存在剂量-效应关系，可防止肝细胞DNA氧化损伤[16]。上述研究报道表明，为更好地发挥有机稀土改善生产性能的效果，需要注意稀土元素种类、有机配合物形式、剂量对抑菌活性和细胞增殖的影响，同时其与植物甾醇复合使用可能有助缓解其对细胞氧化损失作用而进一步改善生产性能。本试验旨在以体外抑菌试验和猪肠上皮细胞增殖试验评估一种有机稀土及其与植物甾醇复合物的应用效果，为探讨有机稀土的科学应用方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

有机稀土(REE)：主要成分为稀土（La、Ce）壳糖胺螯合盐(SQA)、麦饭石，SQA≥12 000 mg/kg，由常宁德邦生物科技有限公司提供。

有机稀土与植物甾醇复合物(REP)：主要成分为SQA≥180 000 mg/kg，植物甾醇≥50 000 mg/kg，由常宁德邦生物科技有限公司提供。

猪肠上皮细胞IPEC-1 株：北京大伟嘉产业创新研究院保存提供。

1.2 有机稀土抑菌试验

参照QBT 2738—2012 悬液定量法，以生理盐水将指示菌(典型大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌)浓度稀释约1×105CFU/ml。分别将3 个批次REE 和REP 样品以无菌水分别稀释至1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml三个浓度梯度，1个批次为1个重复，每个浓度梯度处理组3个重复。吸取稀释液10 ml放入灭菌试管中，30 ℃水浴5 min，水浴后将稀释好的指示菌取200 μl 加入试管中，迅速混匀，并立即计时30 min。以生理盐水代替试验样品，同时按照上述步骤操作，作为对照组。采用LB 培养基计数，统计试验组与对照组存活菌数，抑菌效率(%)=(对照组菌数-试验组菌数)/对照组菌数×100。

1.3 有机稀土作用肠上皮细胞增殖

1.3.1 有机稀土溶解

将REE和REP分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，溶解后过滤除菌。使用前用改良伊格尔培养基(DMEM)稀释，使REE 和REP 终浓度为1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、10 μg/ml，且DMSO 终浓度不超过1.5%，以含相同DMSO浓度的DMEM培养基液为对照组。

1.3.2 细胞培养

细胞复苏传代2～3次后用于试验，将猪肠上皮细胞IPEC-1培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗DMEM培养基中，每隔1 d传代1次，细胞80%融合度时按照1:3 传代比例进行传代，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

1.3.3 有机稀土作用IPEC-1细胞MTT增殖试验

参考文献报道猪肠上皮细胞体外培养调控方法[12]，取对数生长期IPEC-1 采用胰酶消化，以DMEM 培养基悬浮细胞，计数，调整细胞浓度至1×105个/ml。将细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μl，培养24 h至细胞单层铺满孔底。吸出培养基，加入100 μl 1.3.1 已稀释好的对照组和不同浓度梯度有机稀土DMEM 培养基，每组6 个重复。继续培养24 h 后，显微镜下观察。移去培养基，用PBS 洗涤2 次，每孔加入100 μl MTT染色液(2%)，继续孵育4 h。移去上清，每孔加入100 μl 异丙醇，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶免检测仪在595 nm测定吸光度值，细胞活率计算公式如下：

1.3.4 REP作用IPEC-1细胞MTT增殖试验

参照1.3.3 方法以稀释后的REP 代替REE 开展IPEC-1细胞MTT增殖试验，测定IPEC-1细胞595 nm吸光度值和细胞活率。

1.4 统计分析

试验数据经Excel进行初步处理，用SPSS 17统计软件进行分析，数据采用“平均值±标准误”表示。采用T检验法比较REE和REP抑菌效率差异，采用LSD单因素多重比较分析不同浓度REE 和REP 的抑菌效率及其对IPEC-1 细胞增殖的影响，P<0.05 表示组间差异达到显著水平。

2 结果与分析

2.1 有机稀土的抑菌活性

本试验采用悬液定量法评估了不同浓度有机稀土(REE)和有机稀土与植物甾醇复合物(REP)的体外抑菌效率，结果见表1、表2、图1、图2和图3所示。由表1、表2和图1可知，REE 和REP 对大肠杆菌抑菌效率随浓度(1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml)降低而显著降低(P<0.05)，10 μg/ml REP组对大肠杆菌抑菌效率显著低于同浓度REE 组(P<0.05)。由表1、表2 和图2 可知，REE和REP对沙门氏菌抑菌效率随浓度(1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml)降低而显著降低(P<0.05)，10 μg/ml REP 组对沙门氏菌抑菌效率为0，显著低于同浓度REE组(P<0.05)。由表1、表2和图3可知，与对沙门氏菌抑菌效率规律相似的是，REE和REP对金黄色葡萄球菌抑菌效率随浓度(1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml)降低而显著降低(P<0.05)，10 μg/ml REP 组对金黄色葡萄球菌抑菌效率为0，显著低于同浓度REE 组(P<0.05)。从平均抑菌效率来看，高浓度时REE 和REP抑菌效率相近，低浓度时REP组低于REE组。

表1 不同浓度有机稀土(REE)的抑菌效率(%)

表2 不同浓度有机稀土与植物甾醇复合物(REP)的抑菌效率(%)

图1 不同浓度REE和REP对大肠杆菌体外抑菌效率的影响

2.2 不同浓度REE和REP对IPEC-1增殖的影响

为探讨有机稀土及其与植物甾醇复合物对猪肠上皮细胞IPEC-1 增殖的影响，本试验采用MTT 法应用不同浓度REE 和REP 处理IPEC-1 细胞24 h后测定细胞活率，结果见图4 和图5。由图4 可知，1 mg/ml、500 μg/ml REP 组IPEC-1 细胞活率均显著低于对照组(P<0.05)，同时也显著低于100 μg/ml、50 μg/ml、10 μg/ml REP组(P<0.05)。50 μg/ml REP组IPEC-1 细胞活率显著高于对照组(P<0.05)，比对照组提高21.95%(P<0.05)，而100 μg/ml、10 μg/ml REP组与对照组之间均无显著性差异(P>0.05)，50 μg/ml是本试验条件下REP 促进IPEC-1 细胞增殖的最佳剂量。由图5 可知，1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml REE 组IPEC-1 细胞活率均显著低于对照组(P<0.05)，同时也显著低于50 μg/ml、10 μg/ml REE 组(P<0.05)，而50 μg/ml、10 μg/ml REE 组与对照组之间均无显著性差异(P>0.05)。上述结果表明，高浓度REE 和REP 均显著抑制IPEC-1 细胞增殖，适宜浓度(50 μg/ml)REP 显著促进IPEC-1 细胞增殖，本试验浓度条件下未见显著促进IPEC-1 细胞增殖的REE 处理组。

图2 不同浓度REE和REP对沙门氏菌体外抑菌效率的影响

图3 不同浓度REE和REP对金黄色葡萄球菌体外抑菌效率的影响

图4 不同浓度REP对IPEC-1增殖(细胞活率)的影响

图5 不同浓度REE对IPEC-1增殖(细胞活率)的影响

3 讨论

稀土具有广谱抗菌性，稀土（Ce 和La）壳糖胺螯合盐已被列入农业农村部《饲料添加剂品种目录（2013）》中，可用于畜禽、鱼和虾。不同来源稀土的抗菌性能存在差异，以稀土硝酸盐与肉桂酸、8-羟基喹啉合成三种不同稀土配合物，同时合成三种不同稀土元素的吡啶羧酸类配合物，并开展抑菌试验，结果发现不同配合物形式的有机稀土和同一配合物不同稀土元素的有机稀土体外抑菌性能存在差异，稀土配合物的抑菌效果明显优于自由配体[13]。有关壳聚糖有机稀土的抑菌试验也发现稀土配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌性能比单一的水溶性壳聚糖显著提高[8]，不同稀土离子壳聚糖配合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性能也存在差异[1]。为科学应用稀土（铈和镧）壳糖胺螯合盐添加剂的抗菌性能作用，本试验评估了以一种稀土（铈和镧）壳糖胺螯合盐为主要成分的有机稀土(REE)及其与植物甾醇复合物(REP)两种添加剂的体外抑菌性能，结果高浓度(1 mg/ml)REE 和REP 对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用较强，抑菌效率均在90%以上。本试验还发现低浓度REP 抑菌效率低于REE 处理，这可能与有机稀土抑菌作用机制和REP 中所含植物甾醇有关。稀土对菌体确有氧化损伤作用并表现出一定的抑制作用和剂量效应[13]，研究发现植物甾醇具有提高机体抗氧化能力作用[15，17]，这可能是本试验发现低浓度下REP 抑菌效率相对REE 较低的主要原因。

为评定有机稀土及其与植物甾醇复合物对细胞增殖的影响，本试验选用处于对数生长期的猪肠上皮细胞IPEC-1 进一步开展试验。本试验发现，具有高抑菌效率浓度(1 mg/ml、500 μg/ml)REE 和REP 处理均显著抑制IPEC-1 细胞增殖，低抑菌作用浓度(50 μg/ml、10 μg/ml)REE 和REP 对IPEC-1 增殖均无抑制作用。高浓度REE 和REP 抑制IPEC-1 细胞增殖，与研究报道高浓度稀土抑制肝细胞增殖[18]相似。稀土对小鼠成纤维细胞生长的影响试验也发现细胞生长的抑制作用随稀土浓度增加显著增强[19]。本试验发现50 μg/ml REP 处理组细胞活率显著高于对照组，50 μg/ml REE 处理组与对照组无显著性差异，而REP 复合物中有机稀土含量高于REE 组。这表明本试验条件下有机稀土对IPEC-1细胞增殖的影响可能受到植物甾醇的作用，与抑菌试验结果类似。植物甾醇具有抗氧化作用，可防止细胞氧化损伤[16]，关于适宜浓度下REP促进IPEC-1细胞增殖的作用机制仍待于进一步研究。

天然植物提取物在适宜条件下可促进细胞增殖或缓解其他抑制细胞增殖因素的作用，体外MTT 细胞增殖试验发现，博落回生物碱在一定浓度范围内可促进猪肠上皮细胞增殖[20]，从苋科植物牛膝中提取的牛膝多糖能显著促进正常培养条件下猪肠上皮细胞增殖，也能显著缓解脂多糖对细胞增殖的抑制作用[15]。本试验发现不同浓度条件下REP 和REE 在体外抑菌效率和对猪肠上皮细胞增殖调控作用的差异，或许可为开发有机稀土和天然植物提取物在畜禽饲料中的复合应用提供参考。高浓度有机稀土表现出较好的抑菌效果，同时也对猪肠上皮细胞增殖表现出抑制作用，将其与天然植物提取物复合在高浓度情况下仍表现较好的抑菌作用，在适宜浓度下可促进肠上皮细胞增殖，进而有可能通过抑制肠道病菌、增加小肠消化吸收和免疫屏障等功能实现替代抗生素、提高动物生产性能。

4 结论

①有机稀土(REE)及其与植物甾醇复合物(REP)对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效率随浓度降低而显著降低，高浓度下(1 mg/ml、100 μg/ml)REP和REE抑菌效率无明显差异。

②高浓度有机稀土(REE)及其与植物甾醇复合物(REP)抑制肠上皮细胞IPEC-1 增殖，适宜浓度下(50 μg/ml) REP 显著促进细胞增殖，本试验下未见REE处理显著促增殖作用。