妇科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的研究

徐佳 夏伯候 邓静 林丽美 何娟娟 吴梦瑶 龚云 雷磊

〔摘要〕 目的 研究婦科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞体外增殖及免疫调节的影响。方法 分离制备小鼠脾淋巴细胞，将细胞分为空白组（不做任何处理），刀豆蛋白A组（刀豆蛋白A干预，ConA组），LPS组（脂多糖干预，LPS组）及不同浓度的妇科千金胶囊组（FKQ），作用时间分别为24 h、48 h和72 h。CCK8法检测FKQ对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响;MTT法检测ConA及LPS对脾淋巴细胞增殖的影响;流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例并计算CD4+/CD8+的比值;ELISA检测各组细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达。结果 FKQ对小鼠脾淋巴细胞有显著的增殖作用，以浓度为30、40、50 μg/mL时其作用越明显（P<0.01）;FKQ能对ConA诱导的T淋巴细胞及LPS诱导的B淋巴细胞增殖有着明显的促进作用，以浓度为50 μg/mL最显著（P<0.01）;中、高浓度的FKQ协同ConA能升高CD4+的比例，降低CD8+的比例，显著升高CD4+/CD8+的比值（P<0.01）。此外，不同浓度的FKQ均能明显增加IFN-γ及IL-2的表达（P<0.01，P<0.05），降低IL-4和IL-10的水平，以中、高浓度最为显著（P<0.01），调节Th1/Th2平衡。结论 妇科千金胶囊可有效促进脾淋巴细胞增殖，升高CD4+和CD8+比例，促进Th1细胞因子的分泌，使Th1/Th2亚群向“Th1漂移”，调节Th1/Th2平衡，提高细胞免疫应答。

〔关键词〕 妇科千金胶囊;脾淋巴细胞;增殖;免疫调节;Th1/Th2

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.004

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Fuke Qianjin Capsule （FKQ） on the proliferation and immunoregulation of mouse splenic lymphocytes in vitro. Methods After isolation and culture of mouse spleen lymphocytes， cells were assigned into a control group （no treatment）， a ConA group（intervention with ConA）， a LPS group（intervention with LPS） and Fuke Qianjin Capsule of different concentrations （FKQ）. They were treated for 24 h， 48 h and 72 h respectively. CCK8 assay was used to test the effects of FKQ on proliferation of spleen lymphocytes in vitro; MTT method was used to detect the effect of ConA and LPS on the proliferation of splenic lymphocytes; Flow cytometry was used to detect the proportion of CD4+ and CD8+ and calculate CD4+/CD8+ ratio. Moreover， IFN-γ， IL-2， IL-4 and IL-10 were detected by ELISA. Results FKQ at the concentrations of 30， 40 and 50 μg/mL significantly promoted the proliferation of splenic lymphocytes （P<0.01）. FKQ could significantly promote the proliferation of T lymphocytes induced by ConA and B lymphocytes induced by LPS， with the concentration of 50 μg/mL being the most significant （P<0.01）. The medium and high concentrations of FKQ cooperated with ConA increased the ratio of CD4+， decreased the ratio of CD8+， and significantly increased the ratio of CD4+/CD8+ （P<0.01）. Different concentrations of FKQ could significantly increase the expression of IFN-γ and IL-2 （P<0.01，P<0.05）， decreasethe levels of IL-4 and IL-10 （P<0.01）， to regulated the balance of Th1/Th2. Conclusion FKQ can promote the proliferation of splenic lymphocytes effectively， increase the proportion of CD4+ and CD8+， and promote the secretion of Th1 cytokines， thus shifting the Th1/Th2 subpopulation to "Th1"， thereby regulating the Th1/Th2 balance and improving cellular immune response.

〔Keywords〕 Fuke Qianjin Capsule; splenic lymphocytes; proliferation; immunoregulation; Th1/Th2

妇科千金胶囊（FKQ）是中国中药保护品种，收载于2015版《中华人民共和国药典》一部，由千斤拔、金樱根、穿心莲、单面针、功劳木、鸡血藤、当归、党参8味中药材组成，具有清热除湿、益气化瘀的功效。常用于湿热瘀阻所致的带下病、腹痛，症见带下量多、色黄质稠、臭秽、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，既标本兼治，又扶正祛邪，临床上广泛用于妇科炎症，疗效甚佳。方中千斤拔祛风利湿解毒，金樱根清热利湿止带，二者同为君药;穿心莲和功劳木清热除湿，二者同为苦寒之品，合用使全方清热解毒之力增强;单面针以其辛温之性，可防穿心莲、功劳木过于苦寒而傷胃，使全方药性更趋平和，无伤正气之虞，三者共为臣药。当归补血活血、调经止痛，鸡血藤补血、活血、通络，二者合用既能补血调经，又能畅利血行而加强全方清热除湿、活血解毒之功能;党参补中益气、生津养血，与当归、鸡血藤合用气血双补、扶正固本，使全方融扶正、祛邪为一体，三者共为佐药。诸药合用使机体正气得以充养，邪气得以祛除，故诸症消除。

中医学十分重视人体的正气，强调正气是发病的主导，认为“正气存内，邪不可干;邪之所凑，其气必虚”。意指当人的正气在内，气血充足的时候，即机体免疫力正常，“外邪”即致病菌不容易侵犯机体致病;而当人体正气受损，即免疫功能低下时，致病菌容易乘虚而入发病。FKQ的治疗理念在清除致病菌的同时增强机体免疫力，后期通过强化自身免疫能力而防治疾病反复发作。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，是T、B淋巴细胞的主要聚集场所，而T、B淋巴细胞作为机体免疫活性细胞，其激活、分化、增殖在免疫应答过程中起着重要的作用[1]。关于FKQ能调节由环磷酰胺引起的小鼠免疫功能障碍及FKQ组分中药对机体免疫调节研究较多[2-5]，但尚无FKQ对体外培养小鼠脾淋巴细胞的免疫增强活性的报道。因此，本实验以FKQ为研究对象，研究其对小鼠脾淋巴细胞的增殖及免疫调节的影响，以期为FKQ提高免疫作用机制的研究及开发利用奠定理论依据。

1 材料

1.1  实验动物

20只健康BALB/c雌性小鼠，体质量16～18 g，6～7周龄，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。实验动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，自由饮食饮水，实验程序由湖南中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.2  药品与试剂

妇科千金胶囊（FKQ）（产品批号20170231，株洲千金药业股份有限公司）;CCK8（CA1210，北京索莱宝科技有限公司）;胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（16000-044，美国gibco公司）;1640培养基（C11875500BT，美国gibco公司）;DMEM高糖培养基（SH30022.01，Hyclone公司）;ConA刀豆蛋白、LPS脂多糖及MTT噻唑兰（批号分别为C8110、L8880、M8180，北京索莱宝科技有限公司）;Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 ELISA Kit（批号为PI508、PI575、PI612、PI522，上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3  仪器

47103离心机（Eppendorf中国有限公司）;SW-CJ-2FD苏州净化超净工作台（上海叶拓科技有限公司）、Blender 快速组织细胞破碎仪（美国 NextAdvance 公司）、Cyto-Flex 流式细胞仪（美国Beckman公司）。

2 方法

2.1  小鼠脾脏细胞的分离

将小鼠腹腔麻醉后，颈椎脱臼处死，75%酒精将小鼠浸泡15 min;在超净台中取出小鼠脾脏，去除筋膜后反复用PBS冲洗至无血色;将脾脏置于200目细胞筛上，注射器研磨，用PBS冲洗6次后置于培养皿中;收集细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，弃上清;加入10%红细胞裂解液适量，室温静置10 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清;PBS清洗3遍，1 500 r/min离心10 min，弃上清;加入0.85%NaCl溶液重悬沉淀;密度梯度离心加样，1 800～2 000 r/min离心40 min;收集目标分层，PBS清洗3遍;RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1×108，转入培养瓶中37 ℃、5%CO2孵育3 h，去除贴壁细胞，收集悬浮细胞进行后续实验。

2.2  CCK8法检测FKQ对脾淋巴细胞的增殖作用

将FKQ设置成10、20、30、40、50 μg/mL，不同药物浓度孵育小鼠脾淋巴细胞24 h、48 h和72 h。将处理完成的细胞制备细胞悬液，将1×104的细胞数接种到96孔板中，每孔约100 μL细胞悬液，每个浓度设3个复孔，培养12 h使其贴壁。每孔加入10 μLCCK8继续培养1 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，吸光度值与细胞的增殖能力成正比。

2.3  MTT法检测FKQ对ConA诱导脾淋巴细胞增殖的影响

细胞分离、接种方法同前，参考文献[6]，本实验分为空白组，模型组（ConA，5 μg/mL），FKQ组：不同浓度的FKQ（10、30、50 μg/mL）分别干预ConA诱导脾淋巴细胞。于37 ℃，5%CO2培养箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法检测FKQ对ConA诱导脾淋巴细胞增殖功能，测定方法同CCK8法。

2.4  MTT法检测FKQ对LPS诱导的脾淋巴细胞增殖的影响

细胞分离、接种方法同前，参考文献[7]，本实验分为空白组，LPS组（LPS，10 μg/mL），FKQ组：不同浓度的FKQ（10、30、50 μg/mL）分别干预LPS诱导的脾淋巴细胞。于37 ℃，5%CO2培养箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法检测LPS诱导脾淋巴细胞增殖功能。

2.5  流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+亚群的变化

将脾淋巴细胞（1×108）加入24孔板，设空白组、ConA组（ConA，5 μg/mL）和FKQ组：不同浓度的FKQ（10、30、50 μg/mL）分别干预ConA诱导脾淋巴细胞。每组均有3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育48 h，离心收集细胞，磷酸盐缓冲溶液清洗，然后使用小鼠单克隆抗体CD4+-FITC或者CD8+-FITC孵育后磷酸鹽缓冲溶液清洗，流式检测CD4+和CD8+的百分比。

2.6  ELISA法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量

将脾淋巴细胞（1×108）加入96孔板，设空白组（不做任何刺激）、ConA组（ConA刺激）、LPS组（LPS刺激）和FKQ组：不同浓度的FKQ（10、30和50 μg/mL）分别干预ConA诱导脾T淋巴细胞和LPS诱导脾B淋巴细胞，每组均有3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育48 h，收集细胞上清，2 000 r/min室温离心5 min，取上清，按说明书操作，经酶标仪测定OD值。

2.7  统计学处理

使用SPSS 22.0统计学软件整理数据，计量资料以“x±s”表示，当数据符合正态分布时，多组间比较使用单因素方差齐性分析（One-way ANOVA），当P<0.05时差异有统计学意义。

3 结果

3.1  FKQ对脾淋巴细胞的增殖作用

对小鼠脾淋巴细胞分别孵育24 h、48 h和72 h后，结果发现，当细胞孵育24 h，浓度为10、20 μg/mL的FKQ对小鼠脾淋巴细胞增殖无差异（P>0.05）;浓度在30、40、50 μg/mL时对细胞增殖有着显著的促进作用（P<0.01）。当孵育细胞48 h，与浓度为10 μg/mL的FKQ相比，浓度在20、30、40、50 μg/mL时能明显增加脾淋巴细胞增殖（P<0.01），且随着剂量的增加其增殖作用越明显。细胞孵育72 h后，30 μg/mL的FKQ对细胞增殖有促进作用（P<0.05）;40、50 μg/mL的FKQ对细胞增殖促进作用更为明显（P<0.01）。其他浓度组的细胞存活率无显著性差异，说明各浓度组药物对细胞无明显毒性。与培养24 h相比，FKQ浓度为10、30、50 μg/mL时，培养48 h与72 h，对小鼠脾淋巴细胞增殖无影响（P>0.05）;FKQ浓度为20、40 μg/mL时，培养48 h时能明显促进细胞增殖（P<0.01）。见表1。

3.2  FKQ对ConA诱导脾T淋巴细胞增殖的影响

由表2可知，与ConA组相比，10～50 μg/mL的FKQ对T淋巴细胞的增殖具有显著性差异（P<0.01），有显著的量效关系，但只在24 h时剂量依赖性最明显;细胞孵育48 h及72 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异较小，而当其浓度达到50 μg/mL时，其差异变化较大。

3.3  FKQ对LPS诱导脾B淋巴细胞增殖的影响

由表3可知，LPS在不同的孵育时间对B淋巴细胞都有明显增殖促进作用;10～50 μg/mL的FKQ对B淋巴细胞的增殖存在明显差异（P<0.05，P<0.01），在细胞孵育24 h及72 h时剂量依赖性最明显;当细胞孵育24 h及72 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异较小，而当其浓度达到50 μg/mL时，其差异变化较大。当细胞孵育48 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异最大，浓度在50 μg/mL时，其差异最小。

3.4  FKQ对小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+亚群的影响

如图1所示，与对照组相比，在ConA的刺激下，CD4+ T细胞比例显著升高（P<0.01），而随着FKQ的浓度升高CD4+ T细胞的比例出现增加的趋势，但低浓度FKQ与ConA协同效果不明显，而当FKQ达到中、高浓度时开始与ConA产生协同作用（P<0.01）;经ConA刺激后CD8+ T细胞比例降低;中、高浓度FKQ协同ConA能显著升高CD4+/CD8+比值，调节机体免疫功能（P<0.01）。说明中、高浓度的FKQ与ConA能产生协同作用，调节机体免疫平衡。

3.5  FKQ对小鼠脾淋巴细胞INF-γ、IL-2、IL-4及IL-10表达的影响

表4结果显示，与空白组相比，单用ConA和LPS刺激均能显著增加IFN-γ、IL-2的含量，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）;与单用ConA及LPS刺激相比，ConA协同50 μg/mL FKQ能促进IL-2的表达，LPS协同不同浓度的FKQ对IFN-γ、IL-2的表达均有显著促进作用（P<0.01），同时结果发现，与空白组相比，ConA及LPS的刺激显著降低了细胞中IL-4的表达（P<0.01，P<0.05），而增加IL-10的表达（P<0.01）。与单用ConA及LPS刺激相比，FKQ协同ConA、LPS刺激均能降低IL-4、IL-10的表达，尤以中、高浓度最为显著（P<0.01）。

4 讨论

ConA是一种T淋巴细胞有丝分裂原，可刺激静止的T淋巴细胞增殖活化;LPS是一种非胸腺依赖性抗原，可刺激B淋巴细胞增殖[8]。脾淋巴细胞中所含的T淋巴细胞及B淋巴细胞的增殖是机体细胞免疫最直接的反馈[9]。在本研究中，我们分离、培养正常小鼠脾淋巴细胞，采用ConA及LPS诱导刺激后，将不同浓度的FKQ进行协同干预，结果发现不同浓度的FKQ对小鼠脾淋巴细胞的增殖有着显著的促进作用，而且无毒性。这表明FKQ可直接作用于免疫细胞，促进机体免疫细胞的活化、增殖功能，提高机体的免疫力。

外周成熟的T细胞只表达CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，初始CD4+ T细胞接受抗原刺激后，在不同条件下分化成Th1细胞和Th2细胞。Th1主要分泌INF-γ、IL-2，INF-γ具有多种生物活性，能增强Th1细胞活性和细胞免疫功能[10];IL-2能促进T细胞分化、增殖，促进细胞毒T细胞的杀伤作用，增强NK细胞的活性，其分泌水平的高低代表着机体的免疫能力高低[11]。Th2主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，IL-4可促进活化的B细胞和T细胞增殖，是体液免疫和获得性免疫的关键调节因子。IL-10能抑制Th1细胞产生IL-2和IFN-γ，阻碍Th1免疫应答[12]。

由于Th1和Th2细胞都能分泌细胞因子促进自身的增殖并抑制对方的增殖，因此，正常情况下机体中Th1细胞和Th2细胞处于平衡状态。而Th1和Th2的失衡与许多疾病的发生密切相关。如王依静等[13]研究发现盆腔炎患者血清IL-2及CD4+低于健康同龄妇女，而血清IL-4、IL-10及CD8+均高于健康者，且急性盆腔炎患者Th1/Th2的变化明显大于慢性盆腔炎者，同时越严重的盆腔炎其变化越大。这与王娜研究提示慢性盆腔炎患者血清Th2细胞表达（血清IL-6的含量）比Th1细胞表达（血清IL-2含量）具有显著优势，即Th1/Th2平衡向Th2“漂移”，导致免疫功能失调结果一致[14]。伍丽芳[15]临床发现FKQ可以显著升高子宫内膜炎患者血清IL-2、IL-10的表达，而陈小寒发现其能明显降低血清IL-4的水平，增加其抗炎活性，提高免疫应答[16]。而在本研究中发现，FKQ能明显增加淋巴细胞上清中IFN-γ、IL-2的表达，降低IL-4及IL-10的表达，与伍丽芳研究结果相反。在炎症后期，可检测到血清IL-10的水平升高，高表达IL-10可负反馈激活Th2细胞，促进炎症后期纤维化的发展[17]。而在炎症早期，致病菌的感染，使促炎性因子升高，开始介导炎性反应，致炎因子和抗炎因子之间平衡被打破;而在炎症发展过程中，抗炎因子开始逐渐上升，当炎症发展到后期，促炎性因子表达被抑制，而抗炎因子反应增强，Th2细胞占主导作用，导致机体免疫抑制。因而，本研究结果提示FKQ能降低细胞上清IL-10的表达，与临床上FKQ应用于炎症后期、慢性后遗症期一致。在炎症后期，FKQ通过降低IL-10的释放使Th1/Th2亚群向“Th1漂移”，抑制Th2的優势表达，调节Th1/Th2平衡，提高细胞免疫应答。这与王依静研究的盆腔炎发病的免疫机制及FKQ对慢性盆腔炎症的免疫调节作用一致。

本研究结果表明FKQ可有效促进脾淋巴细胞增殖，促进ConA诱导的脾T淋巴细胞增殖及LPS诱导的B淋巴细胞增殖，增加CD4+比例，降低CD8+比例，升高CD4+/CD8+比值，提高机体免疫力。此外，FKQ能减少淋巴细胞向Th2型分化，促使Th1/Th2亚群向“Th1漂移”，抑制Th2的优势表达，调节Th1/Th2平衡，提高细胞免疫应答。本实验不足之处在于未明确FKQ中何种成分发挥主要免疫调节作用，未对FKQ调节免疫机能的作用机制进行探究，本课题组将在后续实验中对不足之处进行完善。

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