食用油中黄曲霉毒素B1含量的测定能力验证

许妍妍　董宇

摘要 [目的]浅析影响食用油中黄曲霉毒素B1检测结果的因素。[方法]根据国标GB 5009.22—2016高效液相色谱柱后光衍生法并优化试验条件。[结果]能力验证样品中黄曲霉毒素B1含量为3.66 μg/kg，相关系数为0.999 9，采用甲醇水（70+30）溶液提取和3 mL/min 的净化速率，加标回收率为98.7%，RSD为0.73%。通过了中国国家认证认可监督管理委员会开展的能力验证《食用油中黄曲霉毒素B1含量的测定》（NIL PT-1637），Z比分数为0。[结论]能力验证结果满意，完善了国标测定黄曲霉毒素B1的细节操作，为广大分析测试人员提供参考。

关键词 黄曲霉毒素B1;能力验证;食用油;高效液相色谱;柱后光衍生

中图分类号 TS227文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）22-0185-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.049

Proficiency Testing for Determination of Aflatoxin B1 in Cooking Oil

XU Yan-yan，DONG Yu （Kaifeng Institute of Food and Drug Control，Kaifeng，Henan 475000）

Abstract [Objective] To study the influencing factors of detection results for aflatoxin B1 in cooking oil.[Method] According to the high performance liquid chromatography（HPLC） column post-optical derivation method of GB 5009.22-2016 and optimized conditions.[Result]Aflatoxin B1 content in the proficiency testing sample was 3.66 μg/kg，the correlation coefficient was 0.999 9，the extraction rate of methanol water（70+30） solution and the purification rate of 3 mL/min were adopted，the standard recovery rate was 98.7%，and the RSD was 0.73%.The ability verification of Determination of Aflatoxin B1 in Cooking Oil（NIL PT-1637） carried out by CNCA had been passed，the score of Z was 0.[Conclusion]The result of capability verification is satisfactory.This method improves the detailed operations of GB 5009.22-2016 and provides a reference for the majority of analysis testers.

Key words Aflatoxin B1;Proficiency testing;Cooking oil;UPLC;Post-column photochemical derivatization

基金项目 开封市科学技术局2020年开封市科技发展计划项目（2003058）。

作者简介 许妍妍（1990—），女，山东日照人，助理工程师，硕士，从事食品检验检测相关研究。

收稿日期 2020-04-17;修回日期 2020-06-04

食用油是居民必需脂肪酸的主要摄入来源，我国常见的食用植物油主要有大豆油、玉米油、菜籽油、花生油、油茶籽油、芝麻油等。由于食用植物油的原料属性及加工属性，极易受到黄曲霉毒素的污染[1]。黄曲霉毒素B1有较高的热稳定性，会引发突变、致畸和肝损伤，是黄曲霉毒素中毒性最强的一种[2]。因此，准确评价食用油中黄曲霉毒素B1的含量是食品安全的必然要求。

为提升实验室检验检测能力，2018年实验室参加了中国国家认证认可监督管理委员会组织开展的由北京中实国金国际实验室能力验证研究有限公司实施的NIL PT-1637《食用油中黄曲霉毒素B1含量的测定》能力验证，样品编号为122018152018010000。该实验室报出结果为3.66 μg/kg，与组织方统计平均值一致，Z比分數为0，能力验证结果满意。按照国标GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第三法高效液相色谱柱后光衍生法[3]，笔者分析了可能影响食用油中黄曲霉毒素B1含量测定结果的要点，并对相关条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。食用油（编号：122018152018010000），北京中实国金国际实验室能力验证研究有限公司;2 μg/mL黄曲霉毒素B1标准溶液，农业部环境保护科研检测所。

1.1.2 试剂。甲醇（色谱级，迪马科技有限公司）;乙腈（色谱级，迪马科技有限公司）。

1.1.3 仪器。CPA-225D分析天平（德国赛多利斯公司）;Multi Reax 涡旋振荡器（德国尔夫）;TGL-16离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）;黄曲霉毒素B1免疫亲和柱（江苏省苏微微生物研究有限公司）;E2695液相色谱仪（美国沃特世）;C18色谱柱（美国沃特世）;PHRED-HR光化学衍生器（北京中科汇仁科技有限公司）。

1.2 方法 参考国标GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第三法高效液相色谱柱后光衍生法进行试验。统计分析运用Excel 2007软件统计分析，差异性检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.1 样品制备。通常样品是指从一批受检的粮油中按规定扦取一定数量具有代表性的部分[4]。为保证样品均匀性，针对植物油样品，国标中明确规定，采样量需大于1 L ，至少采集3个包装，将所有样品在一个容器中混匀后检测。样品取样量太少，容易影响结果偏差太大;取样量过多，可能造成提取过程不完全、超出免疫亲和柱柱容量，使结果产生偏离。此次试验准确称量5 g样品，样品称量前应充分混匀，并且应使样品温度稳定至室温。

1.2.2 样品提取。在100.024 g空白植物油中加入2 μg/mL的黄曲霉毒素B1标准液0.2 mL，摇匀后于阴暗处静置过夜，作为加标样品（含量3.99 μg/kg）。研究甲醇水（70+30）溶液及乙腈水（84+16）溶液对加标样品中黄曲霉毒素B1的提取效果。

1.2.3 样品净化。研究净化流速对回收率的影响，分别采取1、3、5 mL/min的速度对加标样品进行净化分析。

1.2.4 液相色谱条件。流动相为水和乙腈-甲醇（50+50）;进样量50 μL;激发波长360 nm，发射波长440 nm;选取柱后光衍生器时，考虑到柱外死体积的大小对色谱图峰展宽影响很大，在使用细内径（≤2 mm）高效柱时尤为突出[5]，因此光衍生器在连接液相色谱仪时应尽可能使仪器管线流路短，死体积少，以提高检测灵敏度，减少仪器误差。

2 结果与分析

2.1 柱后光衍生器 考虑到柱外死体积效应，满足试验条件前提下尽可能使用内径细、长度短的管线，以降低色谱图峰展宽度。

2.2 标准曲线 标准品尽可能选择有证标准物质;标准品的稀释溶液应与流动相一致，以减弱溶剂效应，减少因色谱峰形差导致的积分误差;标准品选择适宜的标准线性系列，尽可能使待测浓度在线性中间，试验根据预试验选择浓度线性范围为2～6 ng/mL;标准溶液的配制和样品的移取定容应熟练操作，减少操作步骤，定量用到的仪器须经校准后使用，降低标准溶液配制及稀释操作引起的不确定度。标准曲线见图1。

2.3 提取 分别采用乙腈水（84+16）溶液和甲醇水（70+30）溶液，经涡旋振荡器涡旋20 min进行提取，经6 000 r/min 离心10 min后备用，净化过程中控制滤液以3 mL/min 的速度过柱。加标测定结果回收率分别为98.5%和98.7%，无显著性差异（P>0.05），见表1。结合试验成本和溶剂毒性因素，选取甲醇水溶液。

2.4 净化 试验前应将低温保存的免疫亲和柱恢复至室温后再用，并验证小柱的柱容量、柱回收率是否合格。样液上柱、洗柱、毒素洗脱的方法依不同生产厂家产品特性而异，应严格按照产品说明书进行操作。采用不同净化速度的测定结果见表2，净化速率1 mL/min与3 mL/min结果差异不显著（P>0.05），净化速率3 mL/min与5 mL/min的结果差异显著（P<0.05）。为保证充分净化、减少损失，综合试验时间成本及结果，采取控制滤液以3 mL/min的速度过柱。

2.5 能力验证结果 能力验证样品经甲醇水（70+30）溶液提取，以3 mL/min速度经免疫亲和柱净化，按照国标GB 5009.22—2016方法检测，结果为3.66 μg/kg，RSD为0.73%，检测结果与能力验证组织方所出结果一致，Z比分数为0，能力验证结果满意。

3 讨论

提高检验检测样品中待测物结果的正确度需要充分考虑人、机、料、法、环各个环节。检验人员的技术水平和仪器设备的性能对检测结果的准确度均有影响[4]，顺利通过此次能力验证不仅说明该实验室具备相关的检验能力，对检验人员本身也是一个锻炼提高的过程。目标物质提取回收率、标准溶液配制和样品溶液移取定容等操作环节对黄曲霉毒素B1含量的测定结果都有显著影响[4]，因此在检验检测过程中需要检验人员熟悉操作过程，严格按照国标及仪器设备说明书中的方法进行操作，避免操作误差提高检测结果的准确度。黄曲霉毒素B1的稀溶液对紫外光很敏感，遇光易分解，影响测定结果，因此试验须在光线暗淡的环境中进行，可用棕色玻璃仪器。此外次氯酸钠、过氧化氢、柠檬酸、二氧化氯、高锰酸钾及碱等对黄曲霉毒素B1有破坏或降解作用，试验过程中应避免接触上述物质，以减少试验误差[6-9]。黄曲霉毒素B1为强致癌物，操作人员在配制其标准溶液时，必须进行必要的个人防护，试验完毕后仔细洗手。5%次氯酸钠可以立即破坏黄曲霉毒素B1，试验后所用容器、废弃物均应用该溶液浸泡30 min以上，防止二次污染。

能力验证是粮油真菌毒素检测实验室质量控制的重要手段，是衡量粮油真菌毒素检测结果可靠性和可比性的常用方法[10]，做好能力验证对实验室检验检测能力建设、服务市场具有积极意义[11]。

参考文献

[1] 周子焱，邢家溧，应璐，等.食用植物油中黄曲霉毒素B1调查分析[J].中国油脂，2017，42（12）：66-69.

[2] 罗自生，秦雨，徐艳群，等.黄曲霉毒素的生物合成、代谢和毒性研究进展[J].食品科学，2015，36（3）：250-257.

[3] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会， 国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定：GB 5009.22—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]馬冰雪，宋立山，何建华，等.黄曲霉毒素B1检测能力验证分析[J].粮食储藏，2014（3）：48-52.

[5] 闫彩萍，郝润喜.高效液相色谱中柱外效应影响色谱峰参数的实验改良[J].山西医科大学学报，2002，33（4）：375-376.

[6] 王竹天.食品卫生检验方法（理化部分）注解（上）[M].北京：中国标准出版社，2013：639-680.

[7] 王慧林，樊海涛，卢文英.黄曲霉毒素脱毒方法专利技术综述[J].安徽农业科学，2015，43（17）：291-293.

[8] 岳清华，赵仁勇，侯赛，等.几种降解玉米中黄曲霉毒素方法的比较[J].粮食与饲料工业，2015（6）：15-19.

[9] 莫紫梅，袁光蔚，陈宁周，等.黄曲霉毒素降解技术及其降解产物研究进展[J].食品研究与开发，2019，40（2）：188-193.

[10] 王秀嫔，李培武，张奇，等.能力验证中粮油真菌毒素检测技术研究进展[J].中国油料作物学报，2019，41（4）：650-656.

[11] 邓可，刘黎，郭兵，等.能力验证提升实验室检测水平的实证研究[J].冶金分析，2017，37（9）：39-45.