QuEChERS-EMR结合GC-MS检测干制水产品中N-二甲基亚硝胺含量

陆正　陈红波　林刚健　方如意

摘要 [目的]采用QuEChERS结合气相色谱-质谱联用技术建立检测水产干制品中N-二甲基亚硝胺的高效且准确性高的方法。[方法]通过预处理制备条件优化即样品采用乙腈进行提取，利用4 g无水MgSO4和1 g NaCl作为脱水剂，经十八烷基键合硅胶（C18）净化，并通过提取后添加的方法进行基质效应评估。[结果]N-二甲基亚硝胺标准曲线的线性相关系数大于0.99，通过基质匹配绘制标准曲线后能较好地消除基质效应的影响，从而提高定量分析检测的准确度;通过N-二甲基亚硝胺在水产品基质加标3水平（5、10、20 μg/kg）的平均回收率为79.8%～102.1%，相对偏差均小于10%。[结论]该试验方法具有前处理简单、用量少、耗时短、准确性较高等特点，能满足水产品中N-二甲基亚硝胺检测的要求。

关键词 QuEChERS-EMR;GC-MC;干制水产品;N-二甲基亚硝胺;含量测定

中图分类号 TS254.7文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）22-0181-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.048

Detection of N-dimethylnitrosamine in Dried Aquatic Products by QuEChERS-EMR Combined with GC-MS

LU Zheng， CHEN Hong-bo， LIN Gang-jian et al

（Taizhou Food Inspection and Testing Center，Taizhou，Zhengjing 318000）

Abstract [Objective]An efficient and accurate method for the detection of N-dimethylnitrosamines in dried aquatic products was developed using QuEChERS combined with gas chromatography-mass spectrometry. [Method]The pre-treatment conditions were optimized， that was， the sample was extracted with acetonitrile， 4 g of anhydrous MgSO4 and 1 g of NaCl were used as dehydrating agents， purified by octadecyl bonded silica gel （C18）， and matrix effect was evaluated by the method after extraction. [Result]The linear correlation coefficient of the standard curve of N-dimethylnitrosamine was greater than 0.99. The matrix effect could be eliminated by drawing a standard curve through matrix matching， thereby improving the accuracy of quantitative analysis and detection;the average recovery of three levels （5， 10， 20 μg/kg） of N-dimethylnitrosamine in the aquatic product matrix was 79.8%-102.1%， the relative deviations were less than 10%. [Conclusion]This test method has the characteristics of simple pretreatment， small amount， short time-consuming and high accuracy， and can meet the requirements for the detection of N-dimethylnitrosamines in aquatic products.

Key words QuEChERS-EMR;GC-MC;Dried aquatic products;N-dimethylnitrosamine;Content determination

作者簡介 陆正（1994—），男，浙江台州人，助理工程师，从事食品检验检测工作。

收稿日期 2020-04-30;修回日期 2020-05-22

水产食品因低脂肪、高蛋白、营养均衡及味道鲜美等特点而受广大消费者的青睐，其中腌制手法通过抑制肉毒梭状芽孢杆菌及其他腐败菌的生长而提高水产品防腐性能、延长产品货架期，改善产品风味等特点作为水产品的最传统加工保藏方法[1-2]。相关研究结果表明，水产品腌制过程中所加入的硝酸盐和亚硝酸盐可与蛋白质生成胺反应，形成二甲基亚硝胺、吡咯亚硝胺等N-亚硝胺类化合物[3]，其中挥发性二甲基亚硝胺为最常见致癌物质。

GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[4]中规定食品中N-二甲基亚硝胺的限量指标，其中肉及肉制品限量为3.0 μg/kg;水产品及其制品限量为 4.0 μg/kg。GB 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝酸胺类化合物的测定》[5]给出了2种常见检测方法，其中气相色谱-热能分析法由于仪器设备的专用性及其价格较昂贵而受到一定限制;第2种方法为气相色谱质谱法，由于色谱柱为填充柱，且前处理复杂、分析耗时较长同时存在定性不准确容易造成N-二甲基亚硝胺假阳性，不利于消除基质的影响等问题[6]。但目前国内真正具有检测亚硝胺能力的第三方检测机构较少，且对于水产品干制品中N-二甲基亚硝胺国内外鲜有报道，因此开发一种腌制水产品中硝酸铵的高敏感度的检测方法为当今的重点和难点。

QuEChERS（Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）方法自2003年开发出来因其快捷、简单、便宜、有效、耐用和安全等特点而被广泛应用于样品前处理中[7]，该技术中的固相萃取吸附剂的颗粒可吸附水、有机酸等干扰基质，去除样品基质中的油脂色素等大分子干扰目标化合物检测物质，从而降低仪器检测背景和改善峰型，进一步保证定量结果的准确性[8]。该研究针对N-二甲基亚硝胺的化学性质，利用QuEChERS前处理萃取结合适当的吸附剂，通过气相色谱-质谱联用仪测定其含量，建立一种快捷简便、定性定量准确的N-二甲基亚硝胺的检测方法，同时为监测台州市代表性腌制水产品（鳗鱼鲞、墨鱼干、虾仁干、鳐鱼干）中的亚硝胺安全性提供理论基础与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳗鱼鲞、墨鱼干、虾仁干、鳐鱼干，台州市腌制水产品加工企业;乙腈、正己烷、丙酮，均为色谱级，美国天地有限公司;N-二甲基亚硝胺标准品（1 000 mg/L），上海安谱实验科技有限公司;氯化钠、无水硫酸镁（分析纯），上海安谱实验科技有限公司;石墨化炭黑（GCB、40 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18），上海安谱实验科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Trace1300+TSQ8000Evo型气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞世尔科技公司;KS4000ic恒温摇床，德国IKA公司;VOREX3旋涡混匀器，德国IKA公司;AllegraX-30R冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件。

色谱柱Hp-Innowax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升温程序：40 ℃保留1 min，以10 ℃/min升至120 ℃，以20 ℃/min升至240 ℃;载气：高纯氦气，纯度大于99.999%;进样模式：直接进样;柱流速：1.0 mL/min;隔垫吹扫流量：50 mL/min，吹扫时间：1.5 min。

1.3.2 质谱条件。

电子轰击离子化源：EI源;电压70 ev;N-二甲基亚硝胺定量与定性离子：（m/z）74、42、43;离子源温度：280 ℃;传输线温度：280 ℃;选择模式：离子监测（SIM）模式。

1.3.3 标准溶液及标准曲线的绘制。

称取标准样品10 mg，通过乙腈将标准溶液储备液稀释配制成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50 μg/mL系列浓度，分别进样进行测定，绘制基质匹配标准曲线。再以4种水产品干制品空白基质提取液稀释成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50 μg/mL系列浓度梯度的溶剂标准溶液，绘制溶剂标准曲线，用以评定N-二甲基亚硝胺检测过程中的基质效应[9]，经测定得到基质标准曲线和溶剂标准曲线，二者斜率的比值为基质效应的强弱[10]。

1.3.4 QuEChERS前处理。

样品前处理方法参考范广宇等[11]对水产品样品前处理方法，称取10 g样品，加入 10.0 mL 乙腈（含有0.5%冰乙酸），涡旋振荡2 min，加入 4.0 g无水 MgSO4 和1.0 g NaCl，涡旋振荡2 min，4 000 r/min进行离心 5 min。移取上清液1 mL，加入150 mg无水MgSO4和50 mg C18，振荡30 s后于3 500 r/min条件下进行离心5 min，移取上清液经0.22 μm滤膜后装进样小瓶上机测样。

1.3.5 萃取率的测定。

试验采用Xie等[12]的方法利用回收率对萃取率进行评价，其计算公式为：回收率=CS-CpCa×100%，

式中，CS为N-二甲基亚硝胺添加到样品（不含标样）中所测得实际含量（μg/kg）;Cp为空白样品中N-二甲基亚硝胺的含量（μg/kg）;Ca为N-二甲基亚硝胺的标准添加含量（μg/kg）。

1.3.6 试剂样品的测定。

生产基地成品库随机抽样的干制水产品鳗鱼鲞、墨鱼干、虾仁干、鳐鱼干，按照优化后前处理方法进行处理和气相质谱分析测试。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 提取溶劑的选择。

研究结果表明提取溶剂会对N-二甲基亚硝胺含量的检测产生较大的影响，因此该试验在样品预处理前进行提取溶剂的选择。将正己烷、丙酮和乙腈作为提取溶剂进行筛选与选择，试验结果表明（图1），正己烷对目标物质的提取率较低，平均回收率为67%;丙酮和乙腈对上述物质的提取效果较好且回收率均较高，但是丙酮提取的杂质较多极易溶解大分子物质如色素和油脂等，使色谱图上的杂质峰较多，为后续的物质净化带来困难。因此该试验采用乙腈作为提取溶剂，而0.5%冰乙酸的加入掩蔽了色谱系统的活性，进一步改善了峰型及响应值[13]。

2.1.2 盐析和脱水剂的选择。

经过溶液的提取，水产品的干制品中的N-二甲基亚硝胺进入提取层乙腈中，由于乙腈微溶于水，使提取液中少量水分后续分离操作困难。该试验通过对比无水MgSO4和NaCl的不同添加量（5 g+0 g、4 g+1 g、3 g+2 g、0 g+5 g）对N-二甲基亚硝胺提取效率的影响，试验结果通过离心后样品分层情况可知当无水MgSO4和NaCl的添加量为4 g+1 g时分离效果更好。NaCl通过降低水溶性杂质的存在，进而减少了提取液中干扰基质的含量，而通过无水MgSO4可更快除去乙腈中的水分及盐析后的水相层[14-15]，因此该试验采用4 g无水MgSO4和1 g NaCl的添加量。

[7] The SPARTAC Trial Investigators.Short-course antiretroviraltherapy in primary HIV infection[J].New England journal of medicine，2013，368（3）：207-217.

[8] 董蔚，郭凱，李贺贺，等.QuEChERS-GC-MS联用法检测大麦中14种邻苯二甲酸酯类塑化剂及基质效应的影响[J].食品科学，2016，37（24）：156-163.

[9] 方旭元，夏高峰，石巧巧，等.QuEChERS-GC-MS法检测当归中9种除草剂残留[J].华南农业大学学报，2017，38（6）：79-83.

[10] 丁立平，蔡春平，王丹红.改进的QuEChERS-气相色谱-质谱联用法测定蔬菜中的氟吗啉和烯酰吗啉残留[J].色谱，2014，32（8）：849-854.

[11] 范广宇，唐秀，孟祥龙，等.QuEChERS/GC-MS法测定水产品中的硫丹及其代谢物[J].分析试验室，2014，33（11）：1301-1304.

[12] XIE Q L，LIU S H，FAN Y Y，et al.Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the determination of α-tocopherol in pigmented wheat by high-performance liquid chromatography[J].Food analytical methods，2014，7（1）：21-30.

[13] 李春燕，孔祥虹，何强，等.改进的QuEChERS-GC-MS法快速分析茶叶中30种农药残留[J].中国食物与营养，2010（2）：57-60.

[14] DMTROV M，KIRCHNER M，MATISOV E，et al.Possibilities and limitations of fast GC with narrow-bore columns[J].Journal of separation science，2006，29（8）：1051-1063.

[15] SNCHEZ-BRUNETE C，AIBERO B，MARTN G，et al.Determination of pesticide residues by GC-MS using analyte protectants counteract the matrix effect[J].Analytical science，2005，21（11）：1291-1296.

[16] WEI J C，CAO J L，TIAN K，et al.Trace determination of five organophosphorus pesticides by using QuEChERS coupled with dispersive liquid-liquid microextraction and stacking before micellar electrokinetic chromatography[J].Analytical methods，2015，7（14）：5801-5807.

[17] RAJSKI L，LOZANO A，UCLS A，et al.Determination of pesticide residues in high oil vegetal commodities by using various multi-residue methods and clean-ups followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2013，1304：109-120.

[18] MELO A，CUNHA S C，MANSILHA C，et al.Monitoring pesticides residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas-chromatography-mass spectrometry[J].Food Chem，2012，135（3）：1071-1077.

[19] 袁光耀，马玉娥，王素利.柑橘中12种杀菌剂残留的快速分析[J].河北师范大学学报（自然科学版），2007，31（5）：648-651.