养心定悸胶囊预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

汪雁博，郝国贞，姜云发，支 伟，刁敬超，王 庆

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是目前我国致死率及致残率最高的主要疾病之一，其发病率呈逐年上升趋势[1]。AMI治疗的关键是迅速开通梗死相关动脉，尽早恢复心肌组织血流灌注[2]。缺血再灌注损伤是AMI再灌注治疗中的常见并发症，其治疗策略仍有待进一步探索[3]。养心定悸胶囊来源于《伤寒论》中治疗“心动悸、脉结代”的经典名方炙甘草汤，由炙甘草、桂枝、地黄、麦冬、红参、芝麻、生姜、大枣、阿胶9味药材组成，具有益气养血、滋阴复脉的功效。其组方中的主要成分具有抗血栓、抗炎、抗心律失常、保护心肌细胞的作用，可有效改善心肌细胞炎症反应，调节心肌酶活性，减少心肌缺血再灌注损伤[4-5]，但是养心定悸胶囊对心肌缺血再灌注损伤的作用尚不明确。本研究旨在探讨养心定悸胶囊预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，为优化AMI再灌注治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄的健康雄性SD大鼠36只，体质量250～280 g，由河北医科大学动物中心提供，温度(22±1)℃，湿度45%～55%，自由进食、饮水。适应性喂养1周后建立模型。

1.2 药品和仪器

1.2.1 药品 养心定悸胶囊(石药集团河北永丰药业有限公司生产，每粒0.5 g)，配制成溶液，灌胃使用。

1.2.2 主要仪器 超纯水系统(星号：NW10LVF，香港Heal Force)、-70 ℃超低温冰箱(型号：DW HL-668，安徽中科美菱生产)、微量移液器(型号：Proline，苏州BIOHIT生产)、酶标仪(型号：ELX-800，美国BIOTEK生产)、紫外可见分光光度计(型号：Proline，苏州BIOHIT生产)、数显恒温水浴锅(型号：HH-4金坛，荣华仪器)、电热恒温培养箱(型号：DH36001B，天津泰斯特)。

1.2.3 主要试剂 生理盐水(货号：1705020511，中国都邦药业)、磷酸缓冲盐溶液(PBS，货号：P10033，中国双螺旋)、氯化三苯基四氮唑(2，3，5-tripheny ltetrazolium chloride，TTC，货号：T109275，中国阿拉丁)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：WLA004，中国万类生物)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)测试盒(货号：E006，中国南京建成)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(货号：WLE05，中国万类生物)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒(货号：WLE04，中国万类生物)、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(货号：WLA072，中国万类生物)、丙二醛(MDA)试剂盒(货号：WLA048，中国万类生物)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒(货号：WLA110，中国万类生物)。

1.3 分组和模型制备 将大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和养心定悸组，每组12只。

1.3.1 养心定悸组 用0.1 mg/g的养心定悸溶液进行灌胃给药，每日3次，连续7 d。随后给予大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠固定于手术台上，仰卧位，颈部去毛消毒，手术剪剪开皮肤暴露气管，连接至呼吸机行机械通气，设置呼吸频率80次/min，潮气量6～8 mL/kg，呼吸比为2∶1，根据具体呼吸频率及深度适当调整呼吸参数。左前胸去毛消毒，顺肋间隙方向，胸骨左侧切开皮肤1.0～1.5 cm，分离皮下组织和肌肉，入胸后推开胸腺，暴露心脏及大血管根部。剪开心包，在左心耳下缘与肺动脉间可见左冠状动脉前降支起始部，在距离主动脉根部3～5 mm处，以左冠状静脉为标志，用尼龙缝线结扎造成缺血，缝合皮肤，计时器计时45 min。打开尼龙缝线，使血液流通，复灌3 h。结束再灌注3 h后，同步处死大鼠，收集心肌组织及颈静脉血(分离血清)，进行后续实验。

1.3.2 模型组 给予大鼠同养心定悸组相同体积的生理盐水进行灌胃处理，每日3次，连续7 d，手术操作同养心定悸组。

1.3.3 假手术组 大鼠缝线不结扎，其他操作与模型组相同。

1.4 组织病理学观察 结束再灌注3 h后，从右颈动脉注入1% Evans blue 3 mL/kg，区分缺血区和非缺血区心肌。随即取下整个心脏，以PBS冲洗，剪去心房，心室部分垂直于长轴横切成4～6块1～2 mm厚的心肌片，置于1% TTC溶液，37 ℃孵育12 min，将活的心肌组织染成砖红色。经 TTC染色的心肌厚片固定于10%缓冲中性甲醛溶液24 h，用滤纸吸干后称重。双面彩色扫描，图像输入电脑保存。扫描后的心肌片保存在甲醛滤液内，随后石蜡包埋。非缺血区已由苔酚蓝染成蓝色，缺血危险区内包括砖红色的存活心肌及未被染色的灰白梗死组织。根据心肌厚片表面的3种颜色，用电脑图像分析软件(Photoshop 7.0和计算不规则多边形面积软件2.0.4)分别测定双面梗死区面积和缺血区面积占整片心肌切面的百分比。

1.5 心肌损伤标志物和血清标志物测定 准确称取心肌组织重量，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍的生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min离心10 min，制备成10%的匀浆上清液。采用BCA法测定CK-MB和LDH蛋白含量。ELISA测定血清TNF-α、IL-6、超氧化物歧化酶(SOD)和MDA水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较 各组大鼠周龄及体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠依照分组进行处理后，迅速取下心脏，进行TTC染色后，大鼠梗死区心肌呈现白色，非梗死区为暗红色；假手术组大鼠心肌均呈现暗红色，无白色梗死区域出现。详见图1。与假手术组相比，模型组和养心定悸组大鼠心肌梗死面积明显增加(P<0.05)，养心定悸组心肌梗死面积较模型组明显减小(P<0.05)。详见表1。

图1 3组大鼠心肌梗死面积比较

表1 3组心肌梗死面积比较 单位：%

2.2 3组心肌损伤标志物比较 与假手术组比较，模型组与养心定悸组血清CK-MB、LDH水平均明显增高(P<0.05)；养心定悸组血清CK-MB、LDH水平较模型组明显降低(P<0.05)。详见表2。

表2 3组心肌损伤标志物水平比较(±s)

2.3 3组血清标志物水平比较 模型组与养心定悸组TNF-α、IL-6、MDA水平较假手术组明显升高(P<0.05)；养心定悸组TNF-α、IL-6、MDA水平明显低于模型组(P<0.05)。模型组与养心定悸组SOD水平较假手术组明显降低(P<0.05)，养心定悸组SOD水平高于模型组(P<0.05)。详见表3。

表3 3组血清标志物水平比较(±s)

3 讨 论

有研究显示，10%～30%的AMI病人即使开通梗死相关血管后，也未能恢复有效的心肌灌注[6]，即存在着心肌失灌注性微循环障碍和再灌注损伤性微循环障碍的病理生理过程，两者因果互动，导致心肌损伤恶化加重，即缺血再灌注损伤[7]。很多基础和临床研究致力于探讨AMI后缺血再灌注损伤的防治策略[8]，但是目前尚缺乏确切方案。

SD大鼠基因组与人类相似，其冠状动脉侧支循环少，冠状动脉结扎模型稳定性好，是制备缺血再灌注模型的经典动物，已经被广泛应用于AMI缺血再灌注损伤的相关研究中[9]。本实验选用雄性SD大鼠前降支结扎缺血再灌注模型，探讨养心定悸胶囊预处理对缺血再灌注损伤的防治作用。养心定悸胶囊收载于《中国药典》2015版和《新药转正标准》中，其处方来源于《伤寒论》中治疗“心动悸、脉结代”的经典名方炙甘草汤，由炙甘草、桂枝、地黄、麦冬、红参、芝麻、生姜、大枣、阿胶9味药材组成，具有益气养血、滋阴复脉的功效，被广泛应用于心律失常的治疗。方中桂枝味辛温，善温经、通脉、通阳化气；甘草味甘平，能益气复脉，两者配伍，为临床“辛甘化阳”的经典药对。其中，甘草中甘草酸类成分甘草酸和黄酮类成分甘草普具有抗血栓、抗炎、抗心律失常、心肌细胞保护作用，可有效改善心肌细胞炎症反应，调节心肌酶活性，减少心肌缺血再灌注损伤，而桂枝中的主要活性成分桂皮酸和桂皮醛具有降压、解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗凝血等多种药理作用[10-11]。

本研究结果发现应用养心定悸胶囊预处理后大鼠心肌梗死面积减少，提示养心定悸胶囊预处理对减轻心肌缺血再灌注损伤后的心肌梗死面积具有一定的保护作用。

氧自由基的产生及其介导的脂质过氧化是缺血再灌注损伤的重要环节之一，可直接对细胞膜产生损伤作用，增加LDH和CK-MB释放，促使心肌坏死。心肌缺血产生大量氧自由基，作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸，形成氧自由基脂质过氧化的最后产物MDA[12]。因此，MDA可以反映心肌损伤的程度。SOD可清除氧自由基，对抗MDA的损害作用，是心肌内重要的抗氧化酶[13]，具有减轻缺血/再灌注损伤的作用[14]。TNF-α和IL-6是已知的与心肌缺血再灌注损伤有着密切联系的炎性因子[15]，随着再灌注时间的延长，血清TNF-α呈上升趋势[16]，尤其在AMI发生时，TNF-α水平明显升高，TNF-α会诱导大量中性粒细胞黏附心肌细胞，释放毒性物质损害心肌细胞；IL-6则位于调控炎症的枢纽位置，在心肌缺血再灌注损伤中扮演着重要的角色[17]。本研究中养心定悸胶囊预处理的大鼠，SOD水平升高，MDA水平下降，炎症标志物TNF-α、IL-6水平降低。提示养心定悸胶囊具有减轻心肌缺血再灌注后的炎症反应，增加SOD水平，抑制缺血再灌注损伤的作用。

综上所述，养心定悸胶囊预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有预防作用，可能与其抗炎、抗氧化作用有关。但是由于样本量小，观察时间短，其具体机制仍有待进一步深入研究。