乳腺癌基因甲基化的研究进展

郭玉娟，冯映业，王永南，严珊珊*

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，根据最新调查显示2018年全球新增210 万乳腺癌患者，占女性所有癌症病例的25%。中国乳腺癌每年发病率为21.6/10 万女性，死亡率5.7/10 万女性［1］。乳腺癌严重危害人们的身体健康、影响患者的生活质量，同时也给社会带来沉重的经济负担。乳腺癌的发生发展机制十分复杂，涉及癌细胞和宿主细胞两方面之间的相互作用，是一个多阶段、多步骤的复杂过程。研究表明，DNA 甲基化表观遗传学改变所导致的基因表达异常也是乳腺癌发生、发展的重要原因。然而，DNA 甲基化的最新检测技术有哪些，其在乳腺癌早期发现、早期诊断及早期治疗中的作用如何，以及其在乳腺癌临床应用中优势和不足之处何在，这正是本文将研究和探讨的问题。

1 甲基化的定义及检测技术

DNA 甲基化（DNA methylation）指在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，DNA 序列的5"端胞嘧啶5 位碳原子结合上一组甲基的过程，可以稳定遗传给子代DNA序列［2］。DNA 甲基化多发生在富含鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的序列即CpG 岛上，大多数CpG 岛是位于启动子区域，启动子区域的CpG 岛甲基化与转录相关的抑癌基因的失活有关。因此，CpG 岛甲基化模式的定位已成为了解正常基因和病理基因表达的重要工具，可参与多种抑癌基因的转录沉默，是肿瘤发生早期常见的表观遗传事件［3］。依据对样本DNA 的预处理方法，可以将DNA 甲基化检测的手段分为三大类［4］：①基于限制性酶切预处理：通过限制性内切酶HpaII 处理来检测DNA甲基化，保护甲基化CpG 位点，而未甲基化CpG 被酶消化，但是酶处理只能识别CpG 位点（CCGG）之前的胞嘧啶，因此不能完全准确地显示基因组中甲基化情况的全貌；②基于亚硫酸氢盐处理：DNA可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，与未甲基化的DNA 相比，甲基化的DNA 有不同的碱基组成，可使用测序技术对其进行定量分析，是目前DNA 甲基化检测与分析的主流方法，常见的检测方法有甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）、MethyLight、digital MSP、核酸质谱、甲基化芯片、测序等；③基于亲和富集预处理：使用甲基结合蛋白从基因组DNA 中分离出CpG 岛，再使用HpaII 酶切来确认分离区域的甲基化状态，序列通过Southern blotting 或基于微阵列分析，适用于高通量分析，但耗时、昂贵的仪器和数据分析难。

2 基因甲基化与乳腺癌的诊断、监测和随访

流行病学研究显示，早期发现、早期诊断及早期治疗有效于提高乳腺癌的生存率。乳腺癌影像学诊断包括乳腺超声（ultrasonography，US）、乳腺X线摄影（mammography，DM）、乳腺断层摄影（digital breast tomosynthesis，DBT）、MRI、正电子发射断层显像（positron emission tomography-computed tomography，PET-CT）等，是常见的乳腺癌筛查和诊断方式，但因影像学诊断主观性较强、部分检查有射线辐射、以及年轻女性乳腺腺体较致密等，可能导致部分病人过度诊断、过度治疗。因此，需要探讨更准确、高效的分子标志物来提高早期乳腺癌诊断率。DNA 甲基化是乳腺癌中常见的分子事件，且DNA 甲基化修饰过程比蛋白质翻译早。与检测癌症相关蛋白表达水平相比，DNA 甲基化可能成为乳腺癌早期诊断的潜在生物学标志物。

活组织检查是有创性的，不适用于常规的乳腺癌筛查和手术后的常规随访，尤其是在无可见肿瘤病灶的情况下。血液循环中的肿瘤细胞仍可能显示DNA 甲基化特征，因此体液活检等无创方法对于乳腺癌的早期筛查、诊断和治疗后续活动极为重要。Li M 等［5］人在一项荟萃分析评估RASSF1A 甲基化对乳腺癌诊断的价值。本研究共纳入19 篇文献，涉及1849 例患者和1542 例对照。用于诊断乳腺癌的RASSF1A 甲基化的敏感性，特异性，诊断比值比（DOR）和AUC 曲线下面积分别为0.49、0.95、19.0 和0.83。甲基化特异性PCR（MSP）的灵敏度（0.64vs0.57），DOR（21.0vs14.0）和AUC（0.89vs0.86）优于其他方法（q-MSP，OS-MSP 和MethyLight）。MSP 检测血清RASSF1A 甲基化适合诊断乳腺癌。Tang Q 等［6］人荟萃分析基于血液的DNA 中的整体DNA 甲基化概况和基因特异的DNA 甲基化，研究纳入乳腺癌（BC）患者血液来源的DNA 与健康对照相比的甲基化水平，通过全基因组甲基化分析，并用甲基化特异性PCR 验证特定基因特异性甲基化水平，结果发现BC 患者表观基因组全血DNA 低甲基化，发现乳腺癌患者的BRCA1、RASSF1A 甲基化的频率更高，但是证据仍然十分有限。Radpour R 等［7］对十个候选基因（APC、BIN1、BMP6、BRCA1、CST6、ESR-b、GSTP1、

P16、P21、TIMP3）进行研究，研究分为两个队列：第一个队列包含来自乳腺癌患者的36 个血浆样本和健康对照的30 个血浆样本，第二个队列包含60 个三重匹配样本（癌组织，匹配的正常组织和血清样本）来自20 例非家族性乳腺癌患者。研究发现在同一患者的血清和肿瘤组织中，有七个基因显示出一致的甲基化，这支持了以下假设：血清DNA 来源于并准确反映了原发性肿瘤的DNA甲基化谱。使用八个基因（APC、BIN1、BRCA1、CST6、GSTP1、P16、P21、TIMP3）作为开发基于血液的乳腺癌检测方法，可以区分肿瘤和正常样品的敏感性和特异性超过90%。Huang KT 等［8］通过DNA 甲基化分析鉴别原发性乳腺癌和复发性乳腺癌，根据文献报道纳入甲基化的基因（RASSF1A、

TWIST1、APC、WIF1、MGMT、MAL、CDH13、RARβ、BRCA1、CDH1、CDKN2A、TP73、GSTP1），使用这些基因的甲基化图谱在29 个肿瘤（16 个同侧和13个对侧），将69%的同侧肿瘤和15%的对侧肿瘤归为复发。Dedeurwaerder 等［9］人最近进行了详细的全基因组DNA 甲基化分析，分析了248 个乳腺癌肿瘤样本，包括123 个样本的“模型组”（4 个正常和119 个浸润性导管癌（IDC））和125 个样本的“验证组”（8 个正常和117 个IDC），DNA 甲基化谱图将乳腺癌分为六个类型，其中三个类定义了未按表达亚型分类的新基团，这些可能反映了不同的起源细胞。但是，主要样本量太小，无法调查这些甲基化类别的预后价值。可见，基于DNA 甲基化可能作为应用于乳腺癌早期诊断和分型的分子标志物，但目前的研究纳入样本量较少并缺乏前瞻性研究。

3 基因甲基化在乳腺癌治疗中的应用

化疗、内分泌治疗及生物靶向治疗是乳腺癌治疗的重要手段，但由于药物耐药、毒副作用等限制最佳治疗方案的制定，因此，积极寻找特定的分子标志物来预测患者对特定药物的敏感性从而实现个体化治疗显得尤为重要。研究表明DNA 甲基化有望作为预测药物治疗疗效潜在的分子标志物。

3.1 DNA 甲基化与化疗

2018年发表在Breast Care（Basel）的文章提示PITX2 低甲基化的早期淋巴结阳性乳腺癌患者确实受益于基于蒽环类药物的辅助化疗，PITX2 高甲基化的患者DNA 甲基化率（约30%）显示不良的预后，因此应考虑使用其他化疗方案。Absmaier M 等［10］人在一项回顾性研究中，通过甲基化特异性qRT-PCR（qMSP）测定新鲜冷冻的肿瘤组织标本（n=56）中的PITX2 DNA 甲基化状态。对于以辅助全身性蒽环类为基础的化疗方案治疗的非转移性TNBC 患者，PITX2 DNA 低甲基化状态（＜6.35）的非转移性TNBC 患者预后较差。新辅助化疗后未达病理完全反应（pCR）的三阴性乳腺癌（TNBC）患者预后不良，带有BRCA-1 种系突变的TNBC 对紫杉烷的反应可能较弱，Foedermayr M 等［11］研究CMF 在BRCA-1 甲基化或TP53 突变的紫杉类新辅助化疗后术后病理未达pCR 患者中术后辅助化疗的疗效。通过定量甲基化特异性PCR 测定石蜡标本中BRCA-1 甲基化状态，Sanger 测序检测TP53 突变状态，结果发现BRCA-1 甲基化的比例为41.7%，而TP53 突变的比例为66.7%。在27.5 个月的中位随访中，BRCA-1 甲基化患者的DFS 较差（20%vs64.3%，P=0.0472），而TP53 突变状态与预后无关。同源重组（HR）DNA 修复的失调与乳腺癌的致癌性和化学敏感性有关。Watanabe Y 等［12］了16个HR基因的甲基化状态，使用亚硫酸氢盐-焦磷酸测序分析以下HR 相关基因的异常DNA 甲基化状态：BRCA1、BRCA2、BARD1、MDC1、RNF8、RNF168、UBC13、ABRA1、PALB2、RAD50、RAD51、RAD51C、MRE11、NBS1、CtIP、ATM，并分析了它们与肿瘤亚型的关系以及对新辅助化疗的反应。结果发现TNBC 中BRCA1 和RNF8 甲基化的发生率显着高于Luminal 型乳腺癌，BRCA1 甲基化的患者pCR 率 较高，RNF8 甲基化的患者pCR 率较低。2017年Oncol Lett。发表的文章显示局部晚期乳腺癌患者的RASSF1A 和WIF-1 基因甲基化在预测TAC 方案新辅助化疗的临床疗效具有重要的应用价值。

3.2 DNA 甲基化与内分泌治疗

2007年发表在Eur J Cancer 的文章显示PITX2的甲基化可以预测他莫昔芬治疗的激素受体阳性乳腺癌的预后，低甲基化的患者中有86%的患者10年后无转移，而高甲基化程度患者仅为69%［13］。Harbeck N 等［14］通过实时荧光定量PCR 技术检测对比福尔马林固定石蜡包埋的（FFPE）和新鲜冰冻的荷尔蒙受体阳性、淋巴结阴性的乳腺癌组织中PITX2 甲基化，研究石蜡标本中的PITX2 DNA甲基化能否作为预测三苯氧胺内分泌治疗后患者的预后，研究发现实时荧光定量PCR 技术检测新鲜冷冻和FFPE 组织的PITX2 DNA 甲基化具有一致性。

3.3 DNA 甲 基 化 与 抗HER-2 治 疗

对曲妥珠单抗获得性耐药是治疗HER2 阳性乳腺癌患者的主要临床问题。耐曲妥珠单抗的患者的选择是精确肿瘤学的巨大挑战。Yamaguchi T等［15］从前瞻性乳腺癌新辅助临床试验中招募的患者中取活检组织样品，检测HER2 阳性乳腺癌中癌症相关表观遗传学改变。收集24 例HER2 阳性乳腺癌组织样品，通过下一代测序仪分析了409个与癌症相关的基因的遗传变异和通过带有485512 探针的磁珠阵列分析DNA 甲基化状态，结果发现在9 例乳腺癌中WNT 途径可能被其负调控因子（如DKK3 和SFRP1）的异常甲基化激活；在10 例乳腺癌中p53 通路因其下游基因异常甲基化而失活。Palomeras S 等［16］通过全基因组DNA 甲基化（450K 阵列）和转录组分析（RNA-Seq），比较了曲妥珠单抗敏感（SK）和曲妥珠单抗耐药（SKTR）HER2+人乳腺癌细胞模型。分别通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序和qRT-PCR 验证候选基因的甲基化和表达水平。通过基因沉默和过表达在SK 和SKTR模型中进行功能测定。通过亚硫酸氢盐焦磷酸测序法对24 种HER2+人BC 样品中对曲妥珠单抗的治疗有完全反应或无反应的甲基化分析。表观基因组和转录组学分析显示TGFBI 在SKTR 模型中的异位表达表明对曲妥珠单抗治疗的敏感性增加。在原发性肿瘤中，HER2+乳腺癌患者的TGFBI 高甲基化与曲妥珠单抗耐药性显着相关。仍需进一步临床研究验证TGFBI 启动子的高甲基化作为HER2 +乳腺癌患者中曲妥珠单抗耐药性的生物标志物。Ishihara H 等［17］使用TCGA 数据库中的微阵列数据筛选了非癌性乳腺组织中未甲基化的基因和乳腺癌组织中甲基化的基因，并分离了12 个基因，建立基于DNA 甲基化的乳腺癌细胞分数标记。该标记可预测HER2 阳性乳腺癌对曲妥珠单抗的治疗反应。

4 甲基化与乳腺癌的预后

目前肿瘤患者的预后评估多建立在临床病理分期和组织学特征上。然而，相同分期的患者生存时间会存在异质性，因此寻找新模型更准确判断患者预后有重要意义。利用特异性DNA 甲基化发挥分子分型等作用来进行肿瘤预后评估具有巨大潜力。

Györffy B 等［18］研究DNA 甲基化的基因表达与乳腺癌的预后相关性，以及在乳腺癌亚型与DNA甲基化之间的联系。通过对乳腺癌患者的两个队列（n=1938 和n=1640）的荟萃分析，评估了乳腺癌亚型中144 个异常甲基化基因的表达的预后价值。在104 例乳腺癌的模型组中，还研究了不同基因区域中基因表达与DNA 甲基化之间的相关性。分别计算每个基因的生存率和Pearson 相关性分析。48 个基因的表达与乳腺癌预后显着相关（P＜0.05），这些预后基因中的32 个的表达与甲基化相关。特定的甲基化模式已经与乳腺癌亚型相关联，与ER-/基底样肿瘤相比，ER+乳腺癌的特征是甲基化的频率明显更高，表明DNA 甲基化谱可能在不同的乳腺癌亚型的发生和发展中起重要作用，这些异常甲基化的生物标志物在乳腺癌亚型中的预后价值以及DNA 甲基化在不同基因区域中的复杂作用仍是有争议的话题，需要在较大的独立队列中进行进一步验证。此外DNA 低甲基化和高甲基化可能影响乳腺癌的进展和预后，分别导致癌基因的过表达和肿瘤抑制基因的下调［19］。尽管DNA 甲基化通常与基因表达负相关，但仍出现了更为复杂的情况。miRNA 是表观遗传机制的一部分，并且还可以通过DNA 甲基化进行表观遗传修饰，因此其甲基化状态的任何改变都可能影响其表达。Oltra SS 等［20］在35 岁＜的乳腺癌中研究miRNA 编码基因的甲基化差异，以便确定这些患者中潜在的生物标志物，分析了的miRNA 编码基因的9961 CpG位点调节子的甲基化。鉴定了193个差异甲基化的CpG 位点（P＜0.05，甲基化差异为±0.1），基于Infinium Human Methylation 450k 阵列的验证了10 个CpG 位点。使用癌症基因组图谱（TCGA）、Clariom D 和Affymetrix 数据集进行了荟萃分析，观察到miR-124-低甲基化可为老年患者带来明显更高的生存率，并将其确定为BCVY 中潜在的特异性生存生物标志物。Widschwendter M 等［21］研究发现化疗前样本中CTC 和EFC＃93 血清DNA 甲基化阳性的患者中，超过70%的患者在五年内复发；在3～6 个月和6～12 个月内诊断出患有致命性乳腺癌的患者中有42.9%和25%血清EFC＃93 DNA 甲基化。

5 目前存在的问题和展望

乳腺癌发生、发展的过程中DNA 甲基化差异涉及多个基因，高通量测序检测乳腺癌全基因组DNA 甲基化图谱可以对乳腺癌进行准确分类，此类甲基化图谱可用于精准指导乳腺癌的治疗策略，但是检测耗时长、费用高以及精度仍欠佳。部分回顾性研究已经鉴定出的少量DNA 甲基化可作为乳腺癌治疗和预后的预测因子［22］。但关键的问题是这些DNA 甲基化标记物仍缺乏前瞻性研究，另一个问题是仍需确定DNA 甲基化标记是否比当前的组织病理学和免疫化学方法更具优势。

但是到目前为止的利用DNA 甲基化筛查和诊断早期乳腺癌的数据非常有限，开发用于乳腺癌诊断、监测预后的无创性的分子标记尤为重要。初步研究表明，血浆样品中循环的肿瘤DNA 带有特定于肿瘤的DNA 甲基化标记，可为乳腺癌提供潜在的分子标记。到目前为止，尚不清楚基于血液的DNA 甲基化标记物是否具有预后或早期预测价值。此外，尚不清楚原位癌转化浸润性癌时的DNA 甲基化标记，如果存在这种DNA 甲基化标记，可以提供乳腺癌的早期诊断的分子标记物，尤其是在血清DNA 中可以检测出来的标志物。

DNA 甲基化标记物相对于转录谱具以下优势：DNA 甲基化可从石蜡标本中检测，DNA 相对比较稳定，组织材料容易保存，而RNA 很容易被降解，稳定性较差，相关组织标本不容易保存。但要筛选可用于诊断早期乳腺癌、乳腺癌分型、预测治疗及预后的DNA 甲基化标记物仍需进一步研究，同时也需要高通量分析、高精确度、易于检测和低成本的甲基化检测技术。 总之，DNA 甲基化在乳腺癌的早期诊断、基于DNA 甲基化的图谱分型、监测乳腺癌的治疗疗效和预后等方面的展现有潜力的应用前景，进一步有利于乳腺癌的精确诊疗。