噬菌体疗法在口腔感染性疾病中的应用

向盈盈 ，宋 飞，杨向红，周 静，于鸿滨，魏云林，季秀玲

（1） 昆明医科大学附属延安医院口腔科，云南昆明 650031；2） 昆明医科大学第三附属医院微创介入科，云南昆明 650106）；3） 昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500）

抗生素长期、不规范的使用，造成临床耐药性问题日益严重，细菌感染和抗生素耐药是全球公共卫生和医疗保健的重大问题。2016年联合国大会将抗生素耐药性问题列为“最大和最紧迫的全球风险”。万古霉素曾被认为是抵抗耐药菌的最后一道防线，但随着耐万古霉素粪肠球菌的频繁出现及其抗性在菌株间迅速传播，严重危害人类健康，也给临床治疗耐药菌感染带来了难题。随着新型抗生素的不断开发和使用，新的耐药菌也在不断增加。目前，随着“超级细菌”的出现，人类对感染疾病的控制越来越难，而噬菌体治疗重新得到人们的重视。噬菌体能与细菌特异性结合，并且只感染原核细胞，不感染真核细胞[1-2]，是一类具有较大潜力的新一代生物抗菌剂。

2017年“上海噬菌体与耐药研究所”在复旦大学附属上海市公共卫生临床中心挂牌成立，从事噬菌体研究和临床转化，致力于提高我国对抗感染性疾病的医疗能力。2018年8月20 日，该临床中心利用噬菌体成功治愈一例“超级细菌”—多耐药肺炎克雷伯菌引起的尿路感染，这是继1958年余贺教授利用噬菌体治疗皮肤绿脓杆菌感染案例以来的全国第2例。2019年2月19 日，美国FDA 批准了静脉注射噬菌体的临床试验，以挽救感染多重耐药菌而生命垂危的病人。近期Cell Host Microbe 也刊发噬菌体治疗的专题综述报道。这预示着噬菌体治疗将起死回生，对多种抗生素耐药的“超级病菌”的死期可能快到了。

1 微生物与口腔感染性疾病

口腔微环境与外界环境密切相关，随外界环境的改变发生重大改变。同时口腔内自身解剖结构及生长发育，同样影响着口腔微生物的定植；口腔微生物丰度及多样性的改变，会引起口腔多种疾病的发生。

1.1 龋病

龋病是口腔科最常见的细菌感染性疾病。目前的研究认为龋病的发生、发展是口腔中微生态的酸碱平衡被打破，多种细菌共同作用的结果。细菌的菌群失调是打破口腔酸碱平衡的重要原因，而变异链球菌（Streptococcus mutans） 是导致龋病的主要致病菌，但它不一定是主要的优势菌，乳酸菌和放线菌等与龋病的发生发展也有一定的关联。韦荣球菌、棒状杆菌、纤毛菌和丙酸菌以及阿托波菌等细菌同样参与了龋病的形成[3]；Ling 等[4]学者认为链球菌属、韦荣球菌属、放线菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属和硫单胞菌属等与龋病的发病密切相关。Jiang 等[5]分析龈上菌斑认为：缓症链球菌、弯曲菌、二氧化碳噬纤维菌、伯克霍尔德菌和普雷沃菌在高龋的中国学龄前儿童检出率极低。龋病的不同临床阶段，细菌的种类及数量仍有不同，Neves[6]证实双歧杆菌和干酪乳杆菌在牙本质活跃性龋坏中含量较高，变异链球菌在静止性龋损部位中含量相对较高。内氏放线菌、轻型链球菌和戈登链球菌在活跃性龋和静止性龋损中含量无明显改变。

1.2 牙周病

牙周病是指发生在牙支持组织（牙周组织）的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织（牙周膜、牙槽骨、牙骨质） 的牙周炎两大类。牙周疾病是常见的口腔疾病[7]。细菌侵入牙周组织是牙周病发病的一个重要因素[8]。目前发现了超过400 种细菌存在于牙周炎发生部位，而菌斑已确认是牙周病发生、发展的始动因子。牙周病的发生、发展与菌斑内革兰氏阴性厌氧菌密切相关，研究证实口腔内的放线共生放线杆菌、牙龈卟琳菌、福赛类杆菌、中间普氏菌、直型弯曲菌、缠绕优杆菌、微小消化链球菌、链球菌中间复合体、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、产黑菌[9-10]、拟杆菌、隐藏真杆菌、牙髓卟啉单胞菌、栖牙普雷沃菌、微小消化链球菌、消化链球菌、龈沟产线菌、脱硫球茎菌、小杆菌、龈沟螺杆菌、脱铁杆菌、拟杆菌AU126、Division TM7、Division I025、BRC1、OP10 和OP3 等[11]共同参与了牙周炎的形成。

1.3 牙髓及根尖周病

口腔牙髓及根尖周炎是发生于牙齿根尖周组织常见感染性疾病，如牙骨质、根尖周围的牙周膜和牙槽骨等，牙髓及根尖周炎就诊率高达牙体牙髓科门诊的60%。根尖周炎是由于根管内及根尖周定植的微生物群落失调引起，是以厌氧菌为主的混合微生物感染所致[12]。不同个体、感染部位、感染时间的根尖周炎微生物群落组成和多样性具有较大差异，近根尖端较近冠方的微生物有更高的细菌多样性[13]。尽可能地去除根管内感染源是治疗的根本，根管治疗术是目前治疗根管内感染的重要方法，也是首选的方法。通过根管预备、消毒和充填等步骤能有效清除根管内的感染源，阻止病变的发生发展，促进根尖周病灶的愈合。虽然临床上根管治疗成功率不断提高，但患牙仍然存在4%～15%的失败率。究其原因，除根充技术不足外，更加重要的原因是治疗后残留在根管系统中的细菌感染。难治性根尖周炎（Refractory Periapical Periodontitis，RPP） 是临床中经多次规范根管治疗也难于治愈的疾病，造成反复根尖周脓肿和进行性骨质破坏，严重影响患者的生存质量。在难治性根尖周区牙龈卟啉单胞菌、丙酸丙杆菌、微小微单胞菌、粪肠球菌、真菌都有较高的检出率[14]。粪肠球菌（Enterococcus faecalis） 在初发感染的未治疗的根管内数量很低，但在治疗失败的根管微生物检测时发现，粪肠球菌的检出率最高，是最主要的病原菌[14-17]。Nair 等[18]在根管治疗后根尖周持续性感染的患牙标本中发现粪肠球菌的检出率高达77%，甚至成为根管治疗后根管再次感染的唯一检出细菌。根尖周炎经过根管预备、根管消毒和根管充填过程后，根管内的微环境再次改变，细菌丰度及种类发生重大改变，尤其是位于根尖损伤区的根尖段。Siqueira J F[19]研究发现：在炎症持续存在的已充填根管内，乳酸菌（Lactic acid bacteria） 占比由5%以下升高到29～77%，根管内粪肠球菌（E.faecalis） 的占比也明显增加[20]，这是因为根管充填后的缺氧环境抑制了葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、丙酸菌属（Propionibacterium sp.）、普氏菌（Prevotella sp.）、放线菌属（Actinomyces sp.）、链球菌（Streptococcus sp.） 和假单胞菌（Pseudomonas sp.） 等生长，从而造成根管及根尖周菌群失调，而粪肠球菌对恶劣环境的耐受性强，克服缺氧环境继续生长繁殖。因此，控制粪肠球菌感染在根管治疗中十分重要，彻底清除粪肠球菌感染是提高难治性根尖周炎治愈率的关键[21]。

2 噬菌体

噬菌体是一类以原核微生物为宿主的病毒，广泛存在于自然环境中，种类复杂多样，地球上约有1 030～1 032 个噬菌体，其数量相当于细菌的十几倍甚至几十倍[1]。几乎每一个细菌都有其对应的噬菌体。噬菌体结构简单，仅由衣壳蛋白和其内部的遗传物质组成，缺乏独立代谢能力，依靠宿主细胞的核糖体、蛋白质来合成自身生长和增殖所需的各种因子、各种氨基酸和能量。一旦离开宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制，进入静止期。

目前噬菌体分类有以下几种方式：根据其遗传物质的不同，可将其分为ss DNA、ds DNA、ss RNA 和ds RNA 噬菌体；根据形态大小，可将其分为长尾噬菌体科（Siphoviridae）、肌尾噬菌体科（Myoviridas） 和短尾噬菌体科（Podoviridae） 等；根据形状，可将其分为蝌蚪状、丝杆状、球状等；根据对宿主菌的寄生方式，可将其分为裂解性噬菌体、溶原性噬菌体。裂解性噬菌体亦称毒性噬菌体，其生活周期主要包括吸附、侵入、增殖、装配、裂解五阶段。噬菌体在感染寄主细菌后，启动自身早期基因的表达，抑制宿主细菌DNA 合成，合成自身核酸；以自身核酸作为模板，产生大量的结构蛋白，装配产生下一代噬菌体颗粒。溶解酶编码基因表达大量穿孔素（Holin），裂解细胞壁，释放子代噬菌体，再次进入下一个感染周期。溶原性噬菌体（Lysogenic phage） 亦称温和噬菌体，进入宿主细菌内并不产生裂解作用，而将其基因组整合到宿主染色体中，和宿主核酸同步复制，并随着细菌的繁殖传给下一代，宿主细胞不裂解而继续生长。

噬菌体在肠道菌群中扮演非常重要的角色，健康人群中肠道内大约含有1 015 个噬菌体，是自然界中生物体含量最密集的生态生境之一[22]。Qin等[23]通过宏基因组测序发现，124 个粪便标本中约有5%是编码噬菌体的相关蛋白。噬菌体在维持肠腔中菌群之间数量上的平衡方面发挥非常重要的作用，并且可以向宿主菌传递新基因、调节菌群多样性及产生新的特征[24-25]。噬菌体参与杀灭肠道病原菌，维持人体肠道内正常细菌丰度及种群数量。噬菌体还可以通过肠道粘膜上皮进入黏膜固有层，甚至血液系统，参与抗菌以及系统免疫反应。Gorski等[26]研究发现噬菌体能抑制T 细胞和转录因子kB（Nuclear factor kappaB，NF-kB） 的激活，同时抑制体液免疫和细胞免疫。噬菌体在微生态协同进化中同样发挥着非常重要的作用，微生态协同进化本质上就是微生物基因组的变化[27]，使宿主菌对环境的更加适应。当外界有害环境，特别是抗生素作用于宿主菌时，温和型噬菌体和宿主菌互利共生，水平转移基因，使宿主菌产生或获得耐/抗性基因，提高宿主菌生存能力，也间接保障了噬菌体的生存。

3 噬菌体疗法

目前，口腔疾病的治疗方法就是在抗生素的辅助下，进行手术或者非手术清除致病菌，重新达到口腔微生态环境的平稳。口腔微生态环境的失衡是导致疾病发生发展的重要因素。在口腔牙周炎及根尖周炎等感染性疾病中，抗生素的疗效并不理想，预后不良，给患者带来更多的痛苦及经济费用。

噬菌体的应用由来已久[28-30]，具有较好的应用前景[31]。噬菌体已经在动物养殖、水产养殖、细菌分类检测以及环境和食品等领域逐渐应用。从20世纪40年代起，波兰、格鲁吉亚和俄罗斯等西方国家一直致力于噬菌体的研究，把噬菌体用于预防和治疗细菌感染，噬菌体疗法孕育而生。与抗生素相比，噬菌体破坏生物膜的效率更高，噬菌体可以感染存在于生物膜上层的细菌并复制形成新的噬菌体，其可以穿透内层并感染剩余的细菌直至完全清除细菌[32]。

简单来说，噬菌体疗法就是通过噬菌体的宿主专一性来感染细菌，裂解细菌或降低细菌致病性达到治疗人和动物细菌感染的作用[2，33]。关于噬菌体疗法的安全问题一直存在争论，有研究发现部分噬菌体可能含有外毒素[34]。然而，更多的实验证实噬菌体疗法是安全的。在动物中，噬菌体治疗禽类伤寒以及巴斯德菌（Pasteurella） 所致牛出血性败血症均获得的良好的疗效[35]。Smith 等[36]用噬菌体治疗小牛腹泻取得良好的效果。Soothill 等[37]证明噬菌体对豚鼠烧伤后铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）感染有良好的疗效。Cerveny 等[38]研究显示，静脉注射噬菌体可以治疗弧菌（Vibrio） 引起的小鼠感染。在人体上进行的噬菌体安全性试验也证明噬菌体疗法非常有效，而且也是安全的。从1919年Felix d'Herelle[39]在法国首次将噬菌体用于治疗严重痢疾的儿童以来，许多的临床试验取得成功，没有发现任何有害的副作用[40-41]。将高浓度葡萄球菌噬菌体应用于人的鼻腔粘膜、口腔、皮下和静脉，未见明显副作用[42]。在瑞典，15 名健康成年志愿者在他们的饮用水中接受较低的大肠杆菌（Escherichia coli） 噬菌体T4 剂量、较高的噬菌体剂量和安慰剂，结果显示服用大肠杆菌噬菌体的志愿者未发现安全问题[43]。

根据治疗的方式不同，将噬菌体疗法分为以下两种。

3.1 传统噬菌体疗法

传统噬菌体疗法是指将天然分离的毒性噬菌体作为新的抗菌剂直接施用于患者，目的是裂解急性或慢性感染病灶中的致病菌。其优势是噬菌体容易分离得到，但缺点是细菌裂解后可能产生大量的炎性蛋白及爆发性炎症反应，噬菌体宿主谱窄，细菌易产生噬菌体耐性等。Basu 等[44]在小鼠研究中证实，噬菌体疗法能有效治疗铜绿假单胞菌（P.aeruginosa） 引起的伤口烧伤感染，在高致病性肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）[45]、大肠杆菌[46]、多重耐药克伯雷白杆菌（Klebsiella sp.[47]引起的动物肺部感染中，噬菌体治疗也能够有效减少致病微生物生物膜的形成，使肺损伤明显改善，提高动物存活率。Shafiqul 等[48]采用噬菌体鸡尾酒给健康及急性感染腹泻的儿童口服，结果表明噬菌体并不引起急性感染患者的肠道菌群失调，初步证明了口服噬菌体是安全有效的。Singh等[49]利用噬菌体裂解蛋白治疗小鼠金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 菌血症，结果显示疗效较好，小鼠的存活率明显提高。含有噬菌体裂解蛋白的喷剂或软膏能够明显抑制皮肤金黄色葡萄球菌增殖。

噬菌体在口腔疾病治疗方面也有报道，如Li等[50]采用噬菌体局部治疗结核性口腔溃疡，取得了良好效果；而Mario 等[51]从牙科废水中提取伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）的噬菌体用于牙周炎的治疗，Leron 等[52]则在体外利用粪肠球菌噬菌体EFDG1 治疗根尖周炎，结果发现EFDG1 能够很好的抑制粪肠球菌的生物膜形成，可以达到治疗根尖周炎的目的。因此，噬菌体疗法在消灭口腔病原体和清除细菌方面是有帮助的。

3.2 改造噬菌体疗法

由于传统噬菌体疗法的有限性，目前国外研究多集中改造噬菌体疗法。改造噬菌体疗法是指通过改变噬菌种类、数量，分离特异性的噬菌体裂解酶，以及利用现代分子生物学手段和方法改造编码一些功能蛋白的基因，以期解决传统噬菌体疗法中宿主谱窄、耐噬菌体等问题。该方法的优点是机体不易产生过强免疫应答，提高了噬菌体的治疗效果。遗憾的是，目前关于改良噬菌体法应用到口腔疾病治疗尚未见报道。

目前，改造噬菌体疗法取得了一些良好效果。Kim 等[53]通过运用化学方法将非免疫原性聚合物单甲氧基聚乙二醇（mPEG） 附着到噬菌体表面构建的聚乙二醇化噬菌体（PEGylation） 提高噬菌体在血浆中的半衰期。Mahichi 等[54]通过同源重组将广谱噬菌体IP08 的长尾纤维基因gp37 和gp38 转移给窄谱裂解性噬菌体T2，扩大T2 的宿主谱。Ando H 等[55]通过插入失活使金黄色葡萄球菌噬菌体P954内溶素基因丧失功能，编码致死但非裂解性的蛋白，能杀死但不裂解细菌，可有效治疗感染MRSA的免疫低下小鼠。Rotem 等[56]通过λ 噬菌体引入抗生素致敏基因rpsL 和gyrA，可使细菌抗生素敏感性提高2～8 倍。徐晶晶等[57]发现噬菌体裂解酶ClyR在体外实验中对重度低龄儿童龋中的变异链球菌和远缘链球菌（S.sobrinus） 均有较强的杀菌作用，或许可以作为一种防龋方法应用于临床。Furusawa等[58]使用噬菌体来治疗铜绿假单胞菌引起的马角膜炎取得良好的效果。

噬菌体的内溶素最具价值的特性之一是细菌难以形成内溶素抵抗[59]。内溶素降解细胞壁中的肽聚糖，从而破坏细胞壁释放子代噬菌体。噬菌体内溶素（endolysin） 对多株肠球菌[60]、多重耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）[61]等革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖具有良好的裂解作用。对天然內溶素进行截短或嵌合改造，可以提高其热稳定性，扩展宿主谱[62-63]。Yves 等[64]等通过融合多聚阳离子九肽构建出内溶素Artilysins 有效治疗革兰阴性菌感染。内溶素治疗生效快，无毒力因子转导的风险，无免疫原性。

噬菌体的免疫原性不仅与动物机体产生免疫应答[65]，同样细菌也可以产生“噬菌体抗性”来抵抗噬菌体的感染。反之，噬菌体通过改变自身裂解周期、突变衣壳蛋白或尾丝蛋白以及编码anti-CRISPRs 等[66-67]来逃避细菌抗性，这种共生进化动态影响噬菌体的治疗效果，也是今后研究的方向之一。

4 展望

目前从口腔致病菌中分离出的噬菌体数量较少，需要更多的噬菌体分离鉴定以期用于口腔感染性疾病的治疗。大力开展以噬菌体为材料的新型临床非抗生素抗菌治疗方法迫在眉睫。口腔微生物组中的噬菌体相互作用仍然需要探索，在噬菌体的帮助下可以更好的发展口腔“微生物组工程”，以预防和控制口腔感染性疾病。