肠道菌群和免疫在结直肠肿瘤中作用研究进展

梁 睿，淳于纬训，沈 焘，孙 乐，李云峰

（1） 昆明医科大学第三附属医院结直肠外科，云南昆明 650118；2） 昆明医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，云南昆明 650500）

结直肠肿瘤全球发病率在所有肿瘤中排第三位，死亡率排在第二位，在我国，结直肠肿瘤发病率、死亡率均位居第四位，并在10 a 有明显升高趋势，发现新的预防标志物和治疗靶点已成为研究热点。而肠道菌群超过100 万亿，主要定植在人体的结直肠中，在机体免疫系统的形成和疾病抵抗中起着不可或缺的作用。测序技术和宏基因组学的迅速发展，发现肠道菌群与机体免疫系统相互作用，在结直肠肿瘤的发生发展中起到重要的作用。

1 结直肠肿瘤发生发展和肠道菌群的关系

1.1 结直肠癌发生和肠道菌群的关系

2012年[1]有研究表明，具核梭杆菌（Fusobacterium，Fn） 相比与正常组织，在结直肠肿瘤中高度富集，其能诱导局部炎症，增加炎性细 胞 因 子 如 IL-6，IL-8，IL-12，TGF-β，TNF-α 等，从而使结直肠肿瘤的发生。此后越来越多的研究表明，肠道菌群的变化可能是结直肠癌发生不可或缺的部分[1-5]。众所周知，结直肠癌的发生主要沿着腺瘤-CRC 轴进行（由正常粘膜上皮到异型增生、腺瘤、CRC）。结合此发展进程及与菌群变化的关系有两种著名的假说，一是Sears和Pardoll 提出“alpha-bug”假说（类似于Hajishengallis 提出的keystone pathogen 模型）[6-7]，如脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis，ETBF） 可作为主要致病菌，导致结肠菌群重构，引发炎症反应和基因毒性反应，从而导致上皮增生、异性增生，最后导致CRC 的发生。二是Tjalsma 等提出的driver-passenger 模型，驱动致病菌（bacteria driver） 在肠道中繁殖，产生驱动的基因毒素，引起肠道微环境改变和诱发促炎症反应，进而使肠道菌群改变，导致肿瘤发生的菌群丰度增加，在整个肠道菌群中超过驱动致病菌（bacteria driver） 并取代其主导位置导致结直肠肿瘤的进一步发生，如ETBF 最初可能在肠粘膜上定植，通过产生B.fragiliusin 毒素（BFT），colibactin 和细胞死亡毒素（CDT），从而导致肠内环境改变，使梭杆菌和链球菌等在整个肠道微生物群中逐渐超过ETBF，成为新的优势菌群，从而进一步沿着腺瘤-CRC 进行[8]。随着研究的深入，ETBF 和Fn 等与结直肠癌发生相关的特异性菌株被确定。Fn 是口腔中常见的共生菌，是一种具有侵袭性和促炎性的厌氧菌。Mauro Castellarin 等使用RNA-seq 法筛选结直肠癌与正常组织标本后提出Fn 感染在人类结直肠癌中较为常见，揭示了Fn 在结直肠癌的发生中可能起重要作用[1]。Mara Roxana Rubinstein 等进一步研究确认了Fn 可通过FadA 粘附与E-cadherin 结合，激活β-catenin 和Wnt 通路，促进癌细胞增殖，诱导致癌和炎症反应[9]，从而确认了Fn 在结直肠癌中发生中的作用机制。

另一方面，家族性息肉病和结肠炎被认为是结直肠癌的癌前疾病。Dejea Christine M 等[10]证实在家族性息肉病患者中（FAP），当产生BFT 的ETBF 和pks+的大肠杆菌同时存在时才能促进CRC 的发生，ETBF 降解粘液层增加pks+的大肠杆菌的粘附，诱导colibactin 产生，导致结肠上皮细胞DNA 损伤，表明菌群致癌作用在结直肠癌前疾病中同样占有重要地位。已有研究表明患有炎症性肠病（IBD） 的患者，包括克罗恩病（CD） 和溃疡性结肠炎（UC），患CAC（结肠炎相关性CRC） 的风险指数很高，预后较差[11-12]。介于结肠炎和结肠癌之间密切的关系，通过比较炎癌转化之间的细菌变化来找到相关致病菌和开发针对其的特效抗生素成为热点。在急性和慢性的结肠炎性疾病的致病过程中，微生物的主要角色地位已被确定[13-14]。随着化学致癌的小鼠结直肠炎症和肿瘤模型的成功构建为后续的研究垫定了基础。单剂量的氧化偶氮甲烷（AOM） 和三个循环的DSS可以在小鼠体内诱导从结肠炎到结肠肿瘤的模型（CAC），对CAC 小鼠模型的纵向研究揭示了在化学诱导的慢性肠道炎症存在下肠道菌群结构的变化[15-16]。使得在结直肠炎症时期控制菌群变化降低结肠肿瘤的发生成为可能。肠道菌群在炎癌之间的作用已日益明显，随着粪菌移植（FMT） 的飞速发展，或许能够在肠道炎癌的治疗上起到不可或缺的作用。目前临床上以将FMT 治疗复发性艰难梭杆菌列入治疗指南[17]。许多研究已表明FMT 在克罗恩病，肠易激综合征等疾病中治疗的有效性[18-21]。移植健康供体在厌氧条件下制备的混合粪菌，可有效持久的缓解轻中度UC[22]。虽然FMT 在治疗肠道炎症具有一定优势，但其在疾病中的效果和临床试验仍需进一步规范和发展，此外其在结直肠肿瘤中的效果也待研究。

1.2 结直肠癌发展和肠道菌群的关系

近年来随着HMP 计划（人体微生物组计划）和EMP 计划的（地球微生物基因组研究项目） 不断展开，结直肠癌发展中菌群的作用研究也受到越来越多研究者的关注。Chung Yu Ta 等[23]研究发现化疗后复发患者的结直肠癌组织中的Fn 丰度异常增高，并且与患者的临床病理学特征有关，并揭示Fn 靶向TLR4 和MYD88 先天免疫信号传导和特异性微小RNA 以激活自噬途径，导致CRC 的化疗耐受。Deng Xingming 等[24]利用16S rRNA 基因测序检测手术或化疗后结直肠癌患者菌群的变化，发现手术治疗后肠道菌群的多样性显著降低，同时拟杆菌及厚壁菌的丰度降低，以及变形菌的丰度增加；在化疗病人中，一些特定菌株如萨特氏菌、殊异韦荣菌与化疗有关，提示这些细菌可能与化疗抗性存在着潜在的关联。有研究表明，结直肠癌组织中的Fn 等菌群会随着癌细胞一同转移，Fn 可能与其他种属细菌共同作用，促进CRC的肝转移[25]。目前针对结直肠癌临床TNM 分期或病理分级与肠道菌群的研究尚少，了解其进展中菌群的变化可进一步深入了解及完善肠道菌群和CRC 发生发展之间的关系。

这些研究表明肠道菌群结构的变化在CRC 的发生发展中起重要作用，这预示着肠道菌群中的特定菌群变化可以作为结直肠的预防性生物标志物，从而用于早癌筛查是未来研究的方向。此外，针对如Fn 类促癌菌群的特异性抗菌剂也是未来治疗结直肠肿瘤待解决的问题。

2 结直肠肿瘤、肠道菌群和免疫

在过去几年中，随着肠道菌群的研究在神经系统、内分泌系统、泌尿系统等疾病的深入研究，其逐渐被认为是人类第二套的基因，在各种疾病中起着不可或缺的作用[26-28]。人类流行病学研究和小鼠模型实验表明，肠道微生物群决定了抗癌免疫治疗的有效性。因此，微生物群提供了新的预后生物标志物，并显示出作为未来抗肿瘤治疗的前景。肠道微生物组，肠道生理学，全身代谢，免疫系统和肿瘤疾病之间出现了多维功能连接网络。方法学进展标志着笔者能够描述个体细菌物种对肠屏障和机体广泛免疫反应的影响[29-30]。在下文中笔者从菌群和免疫，菌群、结直肠肿瘤和免疫分别讨论。

2.1 肠道菌群和免疫

哺乳动物的胃肠道内有多种微生物群落，包括细菌、真菌和病毒。肠道微生物群形成先天免疫系统和适应性免疫，调节肠道和全身疾病的发病机制[31-32]。而在Paul Wilmes 的研究中发现通过顺产的婴儿会从母体纵向获得拟杆菌门、放线菌门中的23 个分类群（包括拟杆菌属和双歧杆菌属），并且这些菌群和LPS（肠道脂多糖） 的合成有关，LPS 可刺激免疫系统，引起TNF-α 和IL-18 的升高，而剖腹产婴儿体内缺乏这一类菌群，从而影响免疫功能[33]，表明肠道菌群在免疫形成阶段可能也起着不可或缺的功能。

虽然肠道上皮细胞不是传统意义上的免疫细胞，但其配有丰富的免疫受体，这些受体的表达和活性信号转导对肠道菌群的识别，是维持肠道稳态的关键。在上皮特异性缺失的情况下，肠道屏障被破坏，共生菌和肠道固有层分离，导致组织自发性炎症的产生[34]。模式识别受体PRRs（如TOLL 样受体TLRs 和NOD 样受体NOD1 和NOD2）在其中起着关键性作用。TLRs 中肠上皮表达的TLR5，在2 周新生小鼠高表达，深入研究表明TLR5 能够和细菌鞭毛蛋白结合，致使Reg3γ 分泌，限制表达鞭毛蛋白的细菌在肠道定植，确保正常菌群在肠道的建立[35]，表明免疫系统和菌群彼此作用，维持肠道稳态。在小肠潘氏细胞中高表达的NOD2 能够被细菌的肽聚糖激活产生一系列细胞反应，包括细胞因子的分泌，诱导自噬，上皮再生，以及抗菌肽的产生，从而引起菌群结构的改变[36-38]。Khosravi 等[39]的研究表明在缺乏微生物群的情况下，无菌小鼠骨髓中髓样细胞的发育减少，导致全身细菌感染的清除延迟。在肠道中，微生物产生的SCFAs（短链脂肪酸） 可作为改变局部巨噬细胞表达谱信号[40]。目前绝大多数研究集中在先天淋巴细胞（ILCs） 上，研究表明，其发育不受菌群影响，但其正常功能依赖于共生菌的定植，Yoshiyuki Goto 等[41]发现ILC3 在肠道共生菌群的适当刺激下能够分泌IL-22，诱导上皮细胞的岩藻糖基化，抵御外来病原菌。

由上皮细胞分泌的免疫球蛋白IgA 在肠道菌群也有着重要作用，Jehane Fadlallah 等的通过分析IgA 缺乏患者和健康人的粪菌，患者肠道菌群轻度失调，部分促炎分类菌增加，抗炎分类菌减少，说明IgA 能够参与塑造肠道菌群[42]。此外Atarashi K 等研究表明在肠道中的一些细菌如分节丝状菌可粘附在肠道上皮细胞从而诱导Th17 细胞（促炎细胞） 的积累，同时还从溃疡性结肠炎患者粪便中分离出20 种此类细菌[43]，表明肠道菌群有可能是Th17 增殖过程中重要的“刺激剂”。Th17 细胞与Tregs（调节性T 细胞，抑炎细胞） 共同存在于肠道固有层，两者数量的平衡对肠道稳态的维持至关重要，Tregs 可以被细菌的产物短链脂肪酸诱导[44]，这都表明肠道菌群与先天免疫及适应性免疫都存在重要的相互作用。

2.2 结直肠肿瘤、肠道菌群和免疫

越来越多的研究表明，肠道微生物可以影响各种癌症并对癌症免疫治疗的疗效起着重要的作用。2018年发表的几项研究表明在接受过PD-1抑制剂治疗肺癌、肾癌等不同类型肿瘤患者中，未服用抗生素而菌群正常的患者总生存率明显优于服用过抗生素导致菌群异常的患者，在黑色素瘤中同样存在类似结果，表明菌群在免疫治疗中可能起到重要作用[45-47]。此外菌群可能直接作用于免疫细胞改善肿瘤进展，最新研究表明从健康志愿者粪便中分离的11 株菌在联合定植与小鼠肠道时，可通过依赖于CD103+树突细胞和MHC Ia 抗原呈递分子在小鼠肠道诱导生成IFN-γ+CD8T 细胞，增强抗肿瘤免疫，抑制小鼠的肿瘤进程，而这些菌株在人体肠道为低丰度，可能为肿瘤治疗提供新的思路[48]。

在结直肠癌的免疫研究已逐渐深入。Chen Grace Y 等[49]在NOD1-/-小鼠中发现，共生肠道菌群能够通过NOD1 刺激保护肠上皮屏障，以限制对肠上皮的损伤，此外能够特异性激活NOD1 的共生细菌比具有低特异性的细菌更能预防结肠肿瘤的发生，这一研究表明机体免疫和某些共生菌群的相互协助在结直肠肿瘤的发生中可能起到不可或缺的作用。Tsoi Ho 等[50]研究发现厌氧链球菌在人结肠癌和腺瘤组织中高表达，这种细菌通过和肠上皮细胞的TLR2 和TLR4 相互作用，增加ROS（活性氧） 水平，促进胆固醇合成和细胞增殖，从而导致肿瘤的发生。Kostic A 等[51]进一步研究证明，使用ApcMin/+小鼠喂养8 周Fn 和不喂养组作为对照，检测肿瘤中免疫细胞发现喂养Fn能够选择性的增加CD11b+髓样细胞，包括MDSCs（骨髓抑制细胞）、TAMs（肿瘤相关巨噬细胞）、DCs（树突状细胞），这些细胞能够抑制T 细胞的应答，从而促进肿瘤的发展。临床研究证明了Fn 在结直肠肿瘤中所起的作用，鉴于Fn 在下调T 细胞介导的抗肿瘤免疫应答反应中的作用，未来针对Fn 的免疫疗法也是一个开展方向。而Malik Ankit等[52]研究表明IL-33 能够促进IgA 的产生，维持肠道菌群的稳态，从而限制结直肠肿瘤的发生。CTLs（肿瘤细胞毒性T 淋巴细胞）、TH1（辅助性T 细胞）、Tregs（胸腺来源的调节性T 细胞）、Tfh（滤泡辅助性T 细胞） 在结直肠肿瘤中的浸润可延长患者生存期。Cremonesi Eleonora 等[53]通过相关实验证明在肠道菌群的刺激下，结直肠肿瘤细胞分泌大量趋化因子，而这些因子能够招募相关T 淋巴细胞（如CCL5、CXCL9、CXCL10 能够招募CTLs 和Th1，CCL17、CCL22、CXCL12 招募Th1 和Tregs，CXCL13 招 募Tfh，CCL20 和CCL17 能够招募Th17），从而延长患者预后，而CCL20，CXCL10 和CXCL11 的表达水平与细菌负荷明显相关，此外检测到Rikenellaceae，Ruminococcace 和 Lachnospiracee 丰 度 与 CCL5，CCL20 和CXCL11 表达水平之间有着明显的相关性。

至此，笔者以得知肠道菌群具有促进抗肿瘤免疫反应和抑制抗肿瘤免疫反应的双重作用，然而目前对于菌群中有利于肠道保护，抵抗结直肠癌肿瘤的发生的纯培养菌株研究尚少，且机制研究不明确，如何利用菌群的促进抗肿瘤的免疫反应并改善肿瘤免疫微环境，抑制其害处是未来研究的热点。此外如同在其他肿瘤中的作用，调整菌群能否改善免疫治疗对结直肠肿瘤的作用也是新的方向。

3 展望

肠道菌群在肿瘤中的作用吸引了越来越多的研究者关注，对其中机制的研究也在逐渐深入，但仍有大量问题需要解决。人体肠道菌群超过100万亿，与人体细胞数量相同。而目前技术对于菌群的具体研究也只是沧海一粟，对于更多细菌的认识和培养，是未来研究中必不可少的部分。此外，研究表明梭状芽孢杆菌分泌的丁酸盐能够促进Treg 分化，缓解小鼠的结肠炎[44]。表明肠道菌群的代谢物质很大一部分能够对机体产生作用，菌群代谢与肿瘤的治疗相联系仍有很长的路要走。

近年来，肠道中真菌在结直肠癌中的作用也逐渐成为研究热点。在Wang Tingting 等[54]的研究表明接头蛋白CARD 的缺乏可以导致巨噬细胞杀灭真菌的能力受损，小鼠肠道真菌增多，特别是热带念球菌，且其能够将小鼠骨髓细胞诱导为MDSC（骨髓抑制细胞） 从而对免疫细胞CD4+和CD8+T细胞有强力抑制作用从而导致结直肠肿瘤的进展。随着单细胞测序的发展，将其利用到结直肠肿瘤的菌群免疫中，通过对其中的免疫细胞进行分群及其起作用的免疫细胞鉴定可能也是未来研究的方向。

总之，笔者可以明显推断出在结直肠肿瘤的发生发展中，菌群和免疫系统的相互作用一直存在，并起着至关重要的作用。通过早期肠道菌群的变化对结直肠肿瘤进行早期干预治疗将成为未来研究的一个重要方向。而维持菌群和人体免疫应答的平衡，基于肠道菌群的治疗方案将是IBD 和肠道肿瘤的新的突破点。