视网膜光损伤动物模型的研究进展

高园园，黄 洁，俞 洋,2

(1.宁夏医科大学中医学院；2.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

视网膜色素上皮在视觉的形成中占有重要地位，而近年来由光损伤给人们带来的视力困扰日益严重，开展视网膜色素上皮光损伤的临床试验又颇受限制，因此建立与之适应的动物模型进而探讨视网膜光损伤的机制具有深远意义。

1 视网膜光损伤机制与研究进展

随着科技进步，手机、电脑、及一些新的光仪器设备(如发光二极管、LED灯、激光灯等)长时间、高频率使用及间歇性日光照射所引起的视网膜光损伤也不断发生。近年来视网膜光损伤及其药物防治研究逐渐成为眼科领域一个重要的研究课题。视网膜光损伤主要包括热损伤、机械性损伤和光化学损伤(不引起明显温度升高的、低能量的、相对较长时间的光照所引起的视网膜组织的病理变化)，研究表明光化学损伤是最常见的一种损伤形式。杨凯转[1]认为视网膜光损伤主要为视紫红质介导的光化学损伤，视紫红质易吸收光子，遇光分解造成视网膜光损伤。 另有学者认为在视网膜光损伤中 ,光感受器细胞主要通过凋亡的方式失活 ,其机制可能在于视紫红质漂白过程中产生全反视黄醛或其代谢产物启动了凋亡程序[2]。二十世纪80年代由于受科学技术限制，在判断视网膜光损伤的方法上，学者多采用光镜、电镜下观察细胞形态结构改变及测量组织厚度，随着科技进步，判断视网膜光损伤的方法也日趋丰富，如视网膜电图(ERG)、光学相干断层扫描(OCT)、荧光素血管造影术、流式细胞术、免疫印迹等。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium ,RPE)位于视网膜最外层，它是覆盖于Bruch膜上的一种排列整齐、形状规则的六面柱状单层色素细胞,RPE含有黑色素和脂褐素，是进入眼底光线吸收的主要部位,RPE为感觉上皮层提供营养、吞噬和维持新陈代谢等重要功能。其功能概括如下：(1)“加工厂”：视色素的再生与合成(允许视色素再进入视觉周期)； 合成视网膜下腔的粘多糖；形成血液—视网膜屏障；参与脉络膜新生血管形成；生成细胞增殖因子。(2)“维修工”：修复光感受器和玻璃膜。(3)“辅助站”：从脉络膜血管运输氧气、水、离子和营养物质到视网膜外层；维持视细胞和脉络膜毛细血管板。(4)“回收厂”：吞噬、吸收和降解光感受器、外界膜盘[3]。RPE细胞含有大量的线粒体和不饱和脂肪酸，二者对氧化损伤非常敏感，光诱导视网膜氧化应激过程失衡，能诱发活性氧自由基产生，从而造成RPE细胞的一系列损伤、凋亡、膜溶解。而且这些自由基还可以导致感光细胞外段解体、内节线粒体肿胀变性，呼吸链生理功能也随之降低[4]。同时氧化损伤所产生氧的衍生物与不饱和脂肪酸相互作用从而发生脂质过氧化反应，脂质过氧化产物中的醛类化合物具有细胞毒性[5]，进一步加重视网膜损伤。视网膜RPE光损伤的病理过程与年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular degeneration,AMD)的病理过程有许多共同之处。因而，视网膜RPE光损伤成为近年来眼科领域的研究热点。由于开展临床试验具有一定的局限性，因此建立与之适应的动物模型进而探讨视网膜光损伤的机制具有深远的意义。造成动物视网膜光损伤的发生与发展受光照波长、光照能量 、时间和方式等诸多因素影响 ,还与视网膜被照部位 、视网膜暗适应状态 、动物的种属等因素有关。

2 不同波段光与光损伤动物模型

2.1 白色光多数学者采用白色LED冷光源[6]来制作光损伤动物模型，部分学者采用白炽灯[7]作为其光源。选用白色光的目的在于其可反应多种混合光的综合作用，能模拟日光对视网膜损伤，从而构建类似于AMD的模型。

2.2 蓝色光有一部分学者采用频率较高、能量较大的蓝光作为光源[8]，部分学者认为蓝光下细胞生长速度较慢，并且蓝光可引起RPE形态改变，还会引起血-视网膜屏障功能失常。

2.3 紫外线少数学者采用短波长、能量大的紫外线作为视网膜损伤的光源[9]。有学者认为紫外线对视网膜的光损伤是长期的、慢性蓄积的过程，紫外线诱导氧化应激及活性氧的产生[10]可导致RPE变性、功能减退、基底膜增生甚至发生凋亡。

2.4 绿色光尚有学者使用频率低、能量小的绿色荧光灯[11]作为视网膜光损伤模型的光源。

3 不同种属动物与光损伤动物模型

3.1 大鼠昼伏夜动、喜独居、胆小怕惊、喜啃咬、抗病力强、敏感性强、寿命短。多数学者都采用2～3个月SD大鼠。有实验表明裸鼠的视网膜中央上方最敏感 ,在视乳头周围和锯齿缘上的光感受细胞对光损伤的耐受性最强 ；而大白鼠视网膜颞上区最为敏感。史胜[6]等人研究表明光对视盘上方2mm处的视细胞损伤最重。光照前大鼠处于暗适应状态时 ,视网膜光损伤最重,体温升高时光照造成的视网膜损伤加重。(1)循环光照及暗适应：目前多数实验动物,在实验前接受12h明(20～50 lux)及12h暗循环光适应7d,每次光照后立即送回暗环境中饲养[11],可使视杆外节膜盘储存更多的视紫质，而且暗适应可以让实验动物瞳孔散大，不仅节省后期散瞳所需时间而且有利于光损伤的发生。(2)光照时间及光照强度：由于光源选择、光线的屈光介质传导、视网膜个体差异和急性、慢性光损伤动物模型的不同，以至于出现在实验中选择光照时间及强度差别较大的现象。部分学者采用自制光损伤箱，850～1500 Lux之间累计光损伤36h[8]，而多数学者使用2000～6000 lux[6,11]之间累计光损伤6～36 h，在建立急性光损伤模型上，王萧[12]采用手术显微镜强光(30000±50)Lux照射SD大鼠眼睛30min。大鼠视网膜光损伤动物模型具有以下优点：实验技术较成熟；来源广；大鼠视网膜的背中央区域可以被认为是人类视网膜黄斑的一个功能类似物，它是最锐利的视觉区域，动物视网膜损伤的病因和机制与年龄相关的视网膜疾病发展机制有许多共同之处。缺点：实验安全性较低；成本较高。

3.2 小鼠胆小怕惊、昼伏夜动、喜群居、适应性差、寿命短、生长快、繁殖力强，是目前世界上研究最详尽、应用最广泛的哺乳类实验动物，多数学者使用5～8周龄小鼠，15～23g之间。其光损伤动物模型有BALB/c小鼠、WT小鼠、杂交育种小鼠及使用基因敲除技术筛选的小鼠，使用基因敲除、基因测序、分型等技术构建的靶向载体动物模型能高度模仿人类的某些病变，例如Maeda A[13]构建ABCA4-/-小鼠及Rdh8-/-小鼠模型，揭示了AMD的主要特征，提供了视觉周期异常反应可引起类似于AMD渐进变化的基因证据。但是有学者发现Rdh8-/-Abca4-/-小鼠在干和湿型表型都可以由相同的遗传缺陷诱导[14]。(1)循环光照及暗适应：由于选用小鼠种类的不同，学者采用循环光照强度也不同。部分学者采用12h明(20～30、30～50)Lux 12h暗的光照强度下饲养动物7d[19]，也有学者考虑到小鼠较大鼠的适应性更差及小鼠的生理特性，所以让小鼠更长时间适应于较低光照强度的循环光照下，有人采用12h明(5lux)12h暗的循环光照下适应14d，Valérie Fontaine[15]采用12h明(10lux)12h暗的循环光照下适应14d，然后在暗室中适应36h之后开始光损伤。(2)光照时间及光照强度:由于光源及动物模型的不同，大多数学者采用4000～5000 Lux的光照强度[15]，光照持续时间也不同，有光照1h建立急性视网膜光损伤模型[15]，也有持续光照持续3～4 h，比较典型的是LiuY[5]采用12000Lux的强光照射不同时间(30min、60min、75min)以建立急性视网膜光损伤模型。小鼠视网膜光损伤动物模型具有以下优点：①体型小，节省药品；②性情温驯，容易捕捉；③容易饲养，技术成熟；④生长快，繁殖力强；⑤小鼠甚至被认为是AMD的动物模型，因为小鼠可以显示出部分主要的AMD特征。缺点：①寿命短，适应性差，环境要求条件较高；②其视网膜没有黄斑，故所有实验结果为光对整个视网膜的影响，并非黄斑。

3.3 兔哺乳纲、兔形目、兔科，是生物医学实验中最常用的动物之一。实验用兔多为日本大耳白兔、新西兰兔、青紫兰兔、中国白兔等，多数学者多采用月龄适当、健康、清洁、雌雄不限，体重在1.5～2.5 kg的实验兔，Khramov R N等人[16]采用4～7个月、体重2.0～2.5 kg青紫兰兔作为实验动物。(1)光化学损伤：多数学者采用白色荧光灯作为光源照射兔眼睛，由于光照时间及急慢性视网膜损伤模型不同及具体实验条件的限制，Liu Y[5]等采用(15000±10001) Lux照射兔眼2h来建立急性光损伤动物模型。(2)暗适应：实验前，大多数动物在12h明(30～50 Lux)及12h暗的循环光环境适应7d，光损伤前暗适应24h。实验组散瞳至 8mm左右。兔视网膜光损伤模型具有以下优点：①抗病力强，适应性好，繁殖力强，来源广；②兔眼较大，便于手术和观察；③兔眼与人眼结构具有相似性；④兔两眼可以做对照实验；⑤兔与猴的视网膜损伤阈较近、均较高，可能更接近人的视网膜结构。缺点：兔没有黄斑。

3.4 鹌鹑体型小、体重轻、活泼爱动、排序性强、行动敏捷，食性广、喜干燥、恶潮湿，公鹌鹑好斗。P Zak[7]等人使用4～5月龄性成熟雌性日本鹌鹑，使用白炽灯、LED蓝光及黄光下饲养鹌鹑。已知RPE细胞捕获光受体膜的吞噬过程依赖于光，并表现出昼夜节律，有学者认为鹌鹑视网膜光损伤模型是小型家禽研究光损伤动物模型中最成功的模型之一[9]。日本鹌鹑与常规的实验动物(啮齿动物、猫、狗等)相比，具有敏锐的中央视力，被叶黄素、玉米黄质、氧类胡萝卜素保护，蓝光照射对其损害较小。鸟类的视网膜视敏度随着的年龄而明显下降[17]，9个月大的日本鹌鹑RPE中脂褐素颗粒的浓度与80岁成人RPE水平相似[17]。鹌鹑视网膜光损伤模型具有以下优点：鹌鹑除了利用脂褐素作为加速衰老的模型外，还有助于研究褪黑激素调节的昼夜节律，创新性较高，拓展了实验方法。缺点：保种难，耗资多，脱离生产实际，实验技术欠成熟，可重复性有待考究。

尽管视网膜光损伤带给人类的困扰很多，但其发生机制仍无明确的结论，可能与线粒体损伤、细胞凋亡、自由基和脂质过氧化及细胞自噬相关。目前尚无统一的标准制造出光损伤动物模型，随着高效化、科学化、规范化光损伤动物模型的建立及AMD研究的不断深入，AMD的诱因和发病机制也将会逐渐明确。