肝细胞癌CD8+T细胞耗竭机制及免疫治疗的研究进展

刘双池，庞 青，秦中强，范龙飞，段家康，谈 燚

(蚌埠医学院第一附属医院肝胆外科,安徽 蚌埠 233000)

免疫细胞介导的适应性免疫反应在抑制肿瘤的发生发展中起着重要作用。在肝脏免疫微环境中，抗癌免疫功能受损状态是HCC发生的重要标志[1]。循环中的CD8+T细胞浸润到肿瘤组织后，受肿瘤抗原刺激活化为具有杀伤肿瘤细胞作用的效应性 CD8+ T 细胞。在肿瘤抗原持续刺激、免疫抑制细胞(如调节性T细胞和免疫抑制B细胞)抑制以及理化状态失衡(低 pH、缺氧、低营养)等多种因素的影响下，效应性 CD8+ T会逐渐退化为增殖能力减弱、易凋亡、分泌效应细胞因子(IL-6，TNF-α，IFN-γ)水平下降的功能失调状态，称为“T细胞耗竭”[2]。在肝脏慢性感染性疾病中也存在类似的T细胞耗竭现象。免疫治疗已在肿瘤治疗领域中展现出光明前景。耗竭的CD8+T细胞具有独特分子模式和转录特征，为帮助HCC中CD8+T细胞克服免疫抑制因素和恢复抗癌免疫活性提供了新的研究策略。在HCC肿瘤微环境(HCC-TME)中CD8+T细胞耗竭是渐进过程。免疫检查点阻滞剂( Immune Checkpoint Inhibitors,ICIS)仅能有效逆转部分未完全耗竭的CD8+T细胞功能，完全耗竭的CD8+T细胞，对ICIS无反应[3]。这可能就是临床治疗中，很多HCC病人对应用序性细胞死亡受体-1(PD1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)等抗体治疗不敏感的重要原因。在对HCC研究的过程中发现，一些关键基因在CD8+T细胞耗竭中起决定作用。人为干预这些耗竭相关基因可以减缓或停止CD8+T细胞的耗竭进程，部分或完全恢复耗竭状态下CD8+T细胞的功能[4]。本文旨在综述近年来HCC中CD8+T细胞耗竭的研究进展及CD8+T细胞耗竭的治疗措施，一方面对CD8+T细胞耗竭的可能机制进行总结，另一方面为逆转 T 细胞耗竭治疗HCC提供理论依据和证据支持。

1 HCC中CD8+T细胞的耗竭特点

耗竭的CD8+T细胞常表达高水平抑制性受体(Inhibitory Receptors,IRs)，包括程 PD-1、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、CTLA-4、T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(TIM-3)、T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)、CD160、CD244等，也称为免疫检查点(Immune Checkpoint,ICP)。HCC中耗竭的CD8+T细胞可共表达多个IRs，抑制CD8+T对肿瘤抗原的免疫反应。在HCC研究中，IRs常作为CD8+T细胞耗竭的标记物。在乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌(HBV-HCC)研究中发现高表达TIGIT和PD-1的CD8+T细胞容易出现功能失调[5]。Campoli 等对恶性肿瘤细胞中HLA抗原的变化研究发现，HCC中CD8+T细胞耗竭与染色体畸变、转录调节异常及表观遗传修饰有关[6]。通过基因测序分析揭示的HCC中CD8+T细胞耗竭表观遗传学基础及转录机制，发现了与耗竭相关的几个关键分子，如活化T细胞核因子(NFAT)、B淋巴细胞诱导成熟蛋白1 (Blimp-1)、P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)等。这些研究探讨了CD8+T细胞耗竭的基本模式和机制，为恢复HCC-TME中CD8+T细胞的抗癌免疫功能提供了新的策略。

1.1 HCC中IRs与CD8+T细胞耗竭不同的肝癌类型及阶段，耗竭的CD8+T细胞上IRs表达存在显著差异，这表明HCC中CD8+T细胞耗竭可能存在多种分子通路。程序性死亡配体-1(PD-L1) 广泛表达于多种肿瘤类型，能与T细胞上的PD-1结合，降低T细胞功能活性，诱发免疫抑制和肿瘤逃逸。尽管HCC中CD8+T细胞能够高表达PD-1，目前尚不清楚PD-1的过度表达是否直接影响肿瘤浸润CD8+T细胞耗竭。Sakuishi等通过对肝癌小鼠模型中TIM-3和PD-1通路研究发现，与PD-1+TIM-3-和PD-1-TIM-3-CD8+T细胞相比，共表达多个IRs的肿瘤浸润CD8+T细胞更易发生耗竭[7]。IRs主要通过以下几种常见的方式在HCC中实现免疫调节。例如，与刺激性受体竞争性结合配体以减少共刺激信号通路的形成；通过识别TCR信号或负性共刺激分子，产生影响T细胞活化的抑制信号；激活TIGIT/人脊髓灰质炎病毒受体(CD155)信号通路，加速免疫调节树突状细胞凋亡；以及上调共抑制分子TIGIT和下调共刺激分子CD226的表达抑制肿瘤浸润性CD8+T细胞的杀伤活性。

1.2 HCC中免疫抑制因子与CD8+T细胞耗竭一些小的游离或可溶性的分子在CD8+T细胞耗竭过程中起重要作用。HCC中的CD8+T细胞耗竭受多种细胞因子调节，研究发现，白介素-10(IL-10)能够通过识别CD8+T细胞表面的IL-10R抑制T细胞功能，加速T细胞耗竭，促进肿瘤进展[8]。此外，降低HCC-TME中IL-35水平可促进T细胞增殖活化，增强CD8+T对肿瘤抗原的特异性免疫反应。HCC中调节性T细胞(Treg)衍生的 IL-35能诱导CD8+T细胞表达PD-1、TIM3、可溶性纤维蛋白原样蛋白2(Soluble Fibrinogen-like Protein 2,sFgl2)等多种 IRs，加速肿瘤微环境中T细胞耗竭。此外，HCC-TME中肿瘤细胞分泌的多种免疫调节因子参与了CD8+T细胞耗竭。Shali等人在对胞外-5'-核苷酸酶(Extracellular-5'-Nucleotidase,CD73)的研究中发现，HCC肿瘤细中CD73通过上调表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)表达诱导CD8+T细胞耗竭，促进HCC发生和转移[9]。色氨酸-2，3-双加氧酶( Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是人体组织中必需氨基酸色氨酸代谢的限速酶，HCC中IDO上调能够诱导CD8+T细胞耗竭。此外，肿瘤细胞产生的血管内皮生长因子-A(VEGF-A)可通过激活血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)或活化T细胞核因子( Nuclear Factor of Activated T-cells,NFAT)通路促进CD8+T细胞上多种IRs共表达。

1.3 HCC中免疫调节细胞与CD8+T细胞耗竭在HCC-TME中，Foxp3+ Tregs、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated Macrophages,TAMs)和髓系抑制细胞( Myeloid-derived Suppressor Cells,MDSCs)等免疫调节细胞，通过抑制CD8+T细胞的抗癌活性发挥重要的免疫抑制作用。Treg细胞具有免疫调节功能,与多种免疫性疾病的发生和发展有关。Treg细胞通过分泌IL-10、IL-35、TGF-β、IDO和腺苷等多种具有免疫抑制效应分子，在HCC-TME中诱导T细胞耗竭。通过耗竭Treg细胞可以提升抗原特异性CD8+ T细胞对病毒的清除能力和抗肿瘤免疫活性，为HCC治疗提供了新的思路，但Treg细胞耗竭同样对机体产生不可修复的免疫危害，因此限制了该方法在临床中的应用。而通过双重阻断Tregs和PD-L1，能够有效逆转CD8+ T细胞耗竭，降低肿瘤负荷[10]。肿瘤细胞产生的IDO或集落刺激因子1(Colony Stimulating Factor 1,CSF-1) 可以将TAMs和MDSCs募集到TME。TAMs是不能分泌IL-12的类M2型巨噬细胞，但产生的CCL22能诱导Treg细胞抑制T细胞活化。同时，TAMs分泌的前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)和TGF-β会进一步加重免疫抑制[11]。在HCC中，TAMs还可通过分泌PD-L1与效应T细胞上表达的PD-1受体结合，引发T细胞凋亡，并产生重组人精氨酸酶1(Arginase I,ARG1)。ARG1能够抑制T细胞产生自身激活所必需的L-精氨酸[12]。在HCC-TME中，MDSC 通过减少IL-6等细胞因子的分泌抑制 T 细胞活化和浸润。MDSC群体主要分为单核MDSCs(Monocytic myeloid-derived suppressor cells,M-MDSCs)和多形核MDSCs( polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells,PMN-MDSCs)两个亚群。M-MDSCs的数量与体内效应T淋巴细胞受抑制程度呈正相关。PMN-MDSCs通过释放活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)来抑制抗原特异性CD8+T细胞的活性，影响免疫反应[13]。

2 HCC中CD8+T细胞耗竭的转录机制

随着单细胞RNA测序技术在肿瘤CD8+T细胞耗竭转录研究中的应用，HCC中耗竭的CD8+T细胞和正常的CD8+T细胞在转录图谱和基因组别模式上的显著差异得以展现。为便于研究，涉及不同信号通路的相关耗竭因子被人为分作几个不同种类。其中Eomes、NFAT、NFATc1、Blimp-1、T-bet、BATF、GSK3和PSGL1等多种转录因子被认为是T细胞耗竭的关键调节因子。T-bet 和Eomes是富含 T-box 的转录因子，与HCC肿瘤细胞基因启动子区结合后能够促进IFN-γ，Gzmb和穿孔素的表达，诱导CD8+T细胞耗竭。NFATc1作为一种不能与转录激活因子AP-1相互作用的蛋白转录因子，主要功能是通过减弱TCR信号转导及增加HCC细胞表面IRs的表达，来抑制CD8+T细胞对肿瘤的杀伤作用。Chihara 等在对T细胞共抑制基因的研究发现，诱导TGF-β和IL-6生成的转录因子Maf在耗竭的CD8+T细胞中过度表达[14]。此外，Zheng等通过单细胞测序在HCC肿瘤组织中发现了耗竭的CD8+T细胞和Tregs都高表达的layilin基因能够抑制CD8+T细胞的功能[15]。

3 HCC中CD8+T细胞耗竭的表观遗传修饰

不同肿瘤类型或者相同类型不同程度耗竭的CD8+T细胞存在显著的表观遗传差异。在HCC中，SATB1蛋白通过招募核小体重塑和脱乙酰酶(Nucleosome Remodeling and Deacetylase,NuRD)复合物到细胞程序性死亡基因1(Pdcd1)调节区来调控肿瘤反应性T细胞中PD-1的表达，触发对CD8+T细胞的基因抑制[16]。Kim等对HCC中耗竭的CD8+T细胞上表达的4-1BB研究发现，4-1BB能够协同PD-1的表达加速HCC中CD8+T细胞的耗竭[17]。此外，HCC中PD-1的表达还受一种含有RAR、T-bet和SOX3等基本序列的非特异增强子调节[18]。研究证明，阻断PD-1通路后无法通过表观遗传编辑方式将耗竭的CD8+T细胞重新编码为具有抗肿瘤活性的CD8+T细胞[19]，这表明HCC中已耗竭的CD8+T细胞会被“锁定”在一种状态，即使阻断ICP也不能逆转耗竭。因此，阐明HCC中CD8+T细胞耗竭的主要机制及表观遗传学变化特征对于如何提高HCC免疫治疗的效率有着重要指导意义。

4 HCC中CD8+T细胞耗竭的免疫治疗

免疫治疗的主要目的是减轻肿瘤对免疫细胞抑制作用以及恢复和提高受损免疫细胞的抗癌效能。如何修复受损的CD8+T细胞抗癌免疫活性已成为肿瘤免疫治疗中最具挑战性的难题。在HCC中，耗竭CD8+T细胞上表达的多种IRs被视为肿瘤治疗的有效靶点。目前，ICIS在 HCC的治疗中已被广泛应用，对晚期癌症患者，特别是在复发/难治性患者中展示出较好的疗效。然而，良好的治疗效果仅限于少数患者，对大多数晚期HCC患者而言，ICIS疗效远未达预期；此外，鉴于HCC独特的免疫环境，应用ICIS治疗中晚期HCC时可能会诱发严重的类风湿性关节炎和干燥综合征等免疫相关疾病[20]。CD8+T细胞耗竭的不可控性可能是应用ICIS治疗HCC时出现个体间显著疗效差异的主要原因。首先，ICIS只能逆转处于轻度耗竭状态的CD8+T细胞功能，而完全耗竭的CD8+T细胞对ICIS无反应；其次，ICIS需要依赖其特异性配体的辅助才能发挥效能，然而，不同个体耗竭的CD8+T细胞所表达的IRs类型差异很大，导致一种ICIS在不同患者中无法完全辅以特异性配体；最后，体外培养的特异性CD8+T细胞在人体内环境中会被迅速激活，短时间内释放出大量的效应细胞因子诱导CD8+T快速耗竭。

5 讨论

HCC中耗竭的CD8+T细胞特有转录机制和表观遗传修饰，为部分或完全耗竭状态下CD8+T细胞功能修复提供可能。此外，利用体外改造培养的特异性T细胞对耗竭基因表达产生的个体化差异或表观遗传修饰进行干预，为抑制HCC中CD8+T细胞耗竭的激活和进展提供新的治疗思路。同时，减少Treg、TAM、MDSC等免疫抑制细胞的数量以及弱化其相应功能，也有利于提高HCC中CD8+T细胞的抗癌免疫效能。HCC中CD8+T细胞耗竭是一个复杂的综合体系，在很大程度上反映出肝脏肿瘤微环境的失衡。因此，为了克服HCC中CD8+T细胞耗竭，提升免疫治疗效果，应针对CD8+T细胞耗竭原因的不同方面的进行综合治疗。