酶抑制法在农药残留快速检测中的研究进展

王春琼曾彦波李苓陈丹彭丽娟张燕

(1.云南省烟草质量监督检测站,云南 昆明 650106；2.红云红河烟草(集团)有限责任公司会泽卷烟厂,云南 曲靖 654200)

前言

有机磷与氨基甲酸酯类农药残留常用的检测方法为色谱法，如气相色谱、高效液相色谱、气-质联用、液-质联用等技术[1-5]。开发和推广适合我国农产品产销特点的检测技术和方法，研究对现场农产品中农药残留进行快速筛查的检测仪器和系统，对保证农产品的质量安全具有重要的意义。目前，主要速测的方法有速测箱、速测仪、速测卡和速测试剂盒等，这些方法按照技术原理的不同可分为化学法、酶抑制法和免疫法。其中，化学法由于灵敏度低而没有普及；免疫分析法虽然灵敏度高、特异性强，但是抗体制备难度大，只能测定单一种类的农药残留，较难实现广谱性。我国在21世纪初，研究了酶抑制快速检测方法在基层推广应用，此技术是基于氨基甲酸酯和有机磷类农药对乙酰胆碱酯酶具有水解抑制作用的毒理学原理，建立的农残快速检测法，具有使用方便、操作简单和成本低廉等优点，适合现场大量样品的检测和筛选[6,7]。

本文以酶抑制法为基础，系统介绍了原理、酯酶种类、活性及其检测方法，重点综述了酶抑制法在农药残留快速检测上的应用研究，并总结其存在问题，旨在为今后农药残留快速检测方法相关研究提供参考。

1 酶抑制法的基本原理

氨基甲酸酯和有机磷类农药为神经毒剂，会对人体、哺乳动物和昆虫神经传递介质中的乙酰胆碱酯酶水解作用进行抑制，使乙酰胆碱酯酶的水解中断，导致乙酰胆碱底物在体内累积，阻碍神经的正常传导，引发中毒甚至死亡。酶抑制法便是基于氨基甲酸酯和有机磷类农药对乙酰胆碱酯酶的这一毒理学原理应用到农残检测中。酯酶抑制率与氨基甲酸酯和有机磷类农药浓度呈正相关，各种动物及植物都可用作酶源。将样品与酯酶混合反应，若样品不含农残或含量极少，酯酶活性不受抑制，可将底物正常水解，通过电化学方法或光度法检测水解底物；反之，若样品农残含量很高，酯酶活性受到抑制，不能水解底物或水解得较慢，通过测定抑制率推断样品是否含氨基甲酸酯或有机磷类农药及浓度。

2 常用酯酶种类

2.1 昆虫胆碱酯酶

昆虫体内只有乙酰胆碱酯酶1种。据报道，从家绳、蜜蜂及麦二叉蚜等昆虫中得到的乙酰胆碱酯酶已成功进行了分离、纯化或部分纯化。昆虫体内的乙酰胆碱酯酶主要分布在胸部和头部。敏感家蝇由于生活史短(16～18d)，容易饲养，通常被作为酶源材料。提取方法：在-20℃将家蝇冷冻至死后，加入少许干冰和磷酸缓冲液，匀浆、离心，取上清液过滤后冷冻保存备用。

2.2 动物血清酯酶

动物血液乙酰胆碱酯酶含量较高，且来源广泛，廉价易得。已从鸭、马和牛等动物血清中成功提取并纯化出较高活力的乙酰胆碱酯酶。提取方法：将刚抽取的动物血液注入无抗凝剂的试管中，恒温使血液凝团渗出血清，取血清离心，上清液冷冻保存备用。

2.3 动物肝酯酶

鸡肝和猪肝常作为乙酰胆碱酯酶的酶源材料，分离纯化方法与动物血清相同。猪肝中提取的乙酰胆碱酯酶对农药的敏感性较好。提取方法：动物新鲜肝脏加蒸馏水匀浆、离心，取上清液在冷冻保存备用。

2.4 植物酯酶液

20世纪80年代以来，人们开始尝试使用植物酶源替代动物酶源。植物酯酶活性虽不如动物酯酶高，但来源丰富、取材和制备方便、价廉易得、提取和保存较为方便、成本较低。研究结果表明，粮谷类的酯酶较其它植物含量较高，其中小麦的酯酶活性较高。提取方法：取市售面粉，按比例加入蒸馏水，振荡、离心，取上清液过滤，滤液冷冻保存备用。

3 检测方法

3.1 薄层-植物酶抑制法

农药在薄板上展开后，喷面粉酶液，因为农药抑制了斑点上的酶活性导致基质不能水解，而其它部分不被抑制，仍可使基质水解，故喷显色基质溶液后可以显色，通过斑点面积法进行半定量或使用薄层扫描仪进行定量分析。

3.2 速测卡法

农药速测卡是在长方形纸条上，对称贴圆形药片白色、红色各1片。白色药片含胆碱酯酶，红色药片含2,6-二氯靛酚乙酸酯，在胆碱酯酶的催化下，2,6-二氯靛酚乙酸酯迅速水解，产生乙酸和2,6-二氯靛酚(蓝色)。若含有机磷或氨基甲酸酯类农药，胆碱酯酶的活性便会受到抑制而不水解，没有蓝色物质生成。根据白色药片是否变蓝，可推断样品是否含氨基甲酸酯或有机磷类农药及浓度。

3.3 分光光度法

3.3.1 丁酰胆碱酯酶法

碘化硫代丁酰胆碱在丁酰胆碱酯酶的催化下迅速水解，产生丁酸和碘化硫代胆碱，加入显色剂二硫代二硝基苯甲酸，与碘化硫代胆碱发生显色反应，产物呈黄色，在不同时间用分光光度计测定412nm处的吸光度变化值，计算抑制率。通过抑制率可推断样品是否含氨基甲酸酯或有机磷类农药及浓度。

3.3.2 乙酰胆碱酯酶法

在弱碱性溶液中，碘化硫代乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下迅速水解，产生碘化硫代胆碱。碘化硫代胆碱通过还原反应使蓝色的2,6-二氯靛酚褪色，褪色程度与酯酶活性呈正相关，在600nm处测定吸光度，酶活性与吸光度值呈负相关。当样品含氨基甲酸酯或有机磷类农药时，会抑制酯酶活性，吸光度值越高。据此可推断样品是否含氨基甲酸酯或有机磷类农药及浓度。

4 酶抑制法在烟草农药残留快速检测中的应用研究

酶抑制法具有操作简单、检测快速、不需要大型仪器、检测成本低廉等优点，适用于现场大批样品的农残快速筛查。1985年美国报道了一种能用于快速检测田间有机磷和氨基甲酸酯类农药的酶片，检测范围为0.1～10mg·kg-1。美国Neogen公司于1998年又推出了一种商品化试纸片，已经被用于空气、水、土壤和食品等样品农残测定，国内市场也陆续推出如“农药速测卡”和“农药检测卡”等产品。

国外方面，Young Ah Kim等[8]选用Hybond N+作酶的载体、苯基乙酸酯为酶促反应底物，用涂有AChE的试纸条检测实际样品中氨基甲酸酯和有机磷类农残的含量，灵敏度为0.01～0.05mg·kg-1。Wang等[9]利用酯酶比色法对市售生菜中的5种有机磷农药进行检测。结果表明，小麦面粉中提取的酯酶对敌敌畏、甲胺磷、乐果、辛硫磷及马拉硫磷的检出限依次为0.17mg·kg-1、0.11mg·kg-1、0.11mg·kg-1、0.96mg·kg-1、1.70mg·kg-1。Ingrid Walt等[10]用酶标仪实现了多样品中对氧磷和毒死蟀农残含量的测定，检出限依次为0.04mg·mL-1和2.6mg·mL-1。Supanat[11]基于酶抑制原理，制备了西维因农药生物传感器，检测范围为0.001～1mmol·L-1。Reddy[12]利用酶解释放对硝基苯酚可抑制酶活性的特性，制备了测定甲基对硫磷的生物传感器法，线性范围为10～70ppb，检出限为26.32ppb。Salam[13]以乙酰硫代胆碱碘化物为底物，利用杀虫剂可抑制乙酰胆碱酯酶的特性，制备了电化学酶抑制传感器，可用于稻田中杀虫剂测定。Poacnik等[14]制备了一种光热生物传感器，用来检测色拉、洋葱等样品中氨基甲酸酯和有机磷复合物，与GC-MS一致性较好。Tschmelak[15]制备了一种光学免疫传感器，利用全内反射荧光设备来测量水样中的农药含量，灵敏度达到ng·L-1，可用作环境分析中的监测和预警。

国内方面，王继军[16]将自制植物酯酶涂覆在载体上的微孔内壁表面，制得农药快速检测板，灵敏度为0.1～0.01mg·kg-1。于基成[17]等通过比较大豆、玉米、绿豆等10种植物中植物酯酶活性，系统研究了酶促反应条件，建立了快速检测蔬菜中有机磷农药残留的酶抑制法。何颖[18]等利用酶抑制分光光度法检测蔬菜中有机磷农药残留量，回收率分别达到97%、101%和99%。钱立[19]等将电动流动分析与酶抑制法结合，研究了一种测定池塘水中氨基甲酸酯和有机磷类农残折合总量的方法，每小时可测24个样品。

姜彬等[20]基于酶抑制法制备出用于检测有机磷农药的电流型生物传感器，检测对硫磷、辛硫磷和氧化乐果的线性范围分别为5×10-10×10-5mol·L-1、10-9～10-5mol·L-1和5×10-9～10-5mol·L-1，检出限分别为3.24×10-10mol·L-1、1.26×10-10mol·L-1和6.60×10-9mol·L-1。刘涛[21]成功制备了用于测定毒死蜱、丙溴磷和马拉硫磷的酪氨酸酶生物传感器，检测范围为0.25～10ppb、l～10ppb和5～30ppb，检出限分别为0.2ppb、0.8ppb和3.0ppb。

5 存在问题

酶抑制技术经多年发展，在农残快速筛查上已得到广泛运用，但仍存在诸多问题。酶抑制法只适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，且灵敏度有限；酶抑制法测定准确度的影响因素很多，如酶和底物来源及浓度、反应温度、pH值、反应时间和天然抑制剂等，因此酶法测定的重现性不理想；常用的几种酯酶中，乙酰胆碱酯酶的制备比较困难，并且保存时间短，酶失活较严重，酶的来源不稳定，不同来源的酶造成检测结果的重现性和准确性较差。丁酰胆碱酯酶及植物酯酶虽然易得，但测定时专一性较差，假阳性率较高。