蚯蚓在生态毒理试验中的应用研究

邵将 张宗鹏 谢宇震 孙伦涛 成德久

(安徽理工大学地球与环境学院，安徽 淮南 232000)

土壤安全是人类一直关心的热点问题，由于其污染不易察觉且危害巨大，近年来，各种用于监测土壤污染状况、治理土壤污染的方法层出不穷。在这种情况下，以蚯蚓为受试生物，通过监测各污染物对蚯蚓的毒害作用来评价其对生态环境危害程度的方法，即蚯蚓生态毒理试验[1]得到迅速发展。

蚯蚓在土壤中数量庞大，分布广泛，更容易与土壤中各种污染物接触[2]，且蚯蚓的表皮角质层较薄，腺孔发达，对土壤中大多污染物较其它生物更为敏感，能很好地指示土壤污染状况。此外，蚯蚓活动可以改善土壤结构，缓解土壤污染状况，对改良土壤污染具有良好的应用前景[3]。由于蚯蚓这些特点，加上蚯蚓易于养殖，容易采集，因此常被用于评价土壤质量与外援污染物对土壤的影响。本文主要就生态毒理实验常用方法做简要介绍，同时从蚯蚓的改良作用、蚯蚓个体与微观指标对污染物的响应机制来阐述蚯蚓在生态毒理实验中能够起到的作用。

1 蚯蚓生态毒理学试验方法

蚯蚓生态毒理试验研究方法众多，本文主要就其中的实验室急性毒理试验、回避行为实验、在真实生态系统中进行的田间试验、生物检测法和生物标记法[4]进行简要介绍。

1.1 急性毒性试验

急性毒性试验指蚯蚓经1次或短时间内多次给予受试物，通过测量致死和非致死的指标参数，来表征污染物毒性效应[5]。该方法简单、快速，应用广泛。目前，急性毒性试验广为应用的有以下4种方法。

1.1.1 滤纸接触法

将赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)或安德爱胜蚓(Eisenia andrei)放置于玻璃瓶中(瓶中放有标准化滤纸条)，48h后测定其死亡率，并计算半致死浓度(LC50)[6]。此法简单易行，效率高，测试效果显著；但此模式受制于污染物毒性信息只能通过皮肤接触获得，对环境中污染物的真实影响反馈难以准确评估。

1.1.2 人工土壤试验法

在人工土壤中填充浓度不同的污染物，后将具有成熟环带的赤子爱胜蚓或安德爱胜蚓置于其中，让其暴露在污染物中，14d后观察其行为和存活状况，并计算出半致死量(LD50)[6]。此法较为繁琐，且人工土壤组分还可能与被测物质发生反应而对试验结果造成影响。但这种方法可以较为准确地反映出蚯蚓在真实环境中受到污染物胁迫时的反应，从而得出污染物的毒性效应。

1.1.3 人造土壤试验

这种方法改良了人工土壤试验中土壤组分的问题，以定形水合性二氧化硅粉和玻璃球(直径1.5～2cm)代替人工土壤[7]，不仅大大简化了实验步骤，还杜决了土壤组分与被测物质发生反应的可能，使实验结果更为准确。

1.1.4 自然土壤试验法

该法与人造土壤实验只有蚯蚓生活基质的差别，采用自然土壤作为生活基质所得实验结果能更为真实地反映出污染物对环境的影响，但是不同地区自然土壤性质有差别，实验结果往往不具有可比性。

1.2 田间试验法

在现实环境中，通过观察蚯蚓种类、数量和生物量等指标，测定某种污染物质对蚯蚓种群影响的方法[1]。该方法能够直接反映出污染物在自然界中的影响，但操作繁琐，耗时较长，且受地域环境限制较大，不同地区可比性较差。

1.3 生物检测法

通过分析污染物残留，对比污染区域与未污染区域(土壤类型相同)蚯蚓个体与种群特征，阐明环境污染状况[1]。该法费用低廉，能够直接反映出污染物对土壤生物的毒害作用，但是只能在污染发生后评估污染物毒性。

1.4 生物标记法

根据污染物引起的蚯蚓生理、生化、体内细胞和分子指标的变化来判断污染物环境影响的方法[6]。该方法能够直观准确地反应污染物对生物微观结构的影响，但费用较高，且操作较为复杂。

1.5 蚯蚓回避行为实验

蚯蚓回避行为实验是以蚯蚓48h对某一浓度化合物的行为反应来判断其毒性。该方法省时省力、成本低廉，具有较高的反应灵敏度[8]，而经生物修复后的土壤污染物浓度较低，因此可以通过蚯蚓回避行为试验来确定污染土壤的生物修复效果。

2 蚯蚓强化污染土壤修复的能力

污染土壤的理化性质恶劣，土壤肥力流失，蚯蚓活动可以改良土壤，提升土壤肥力，改善土壤酸度，而且蚯蚓可以吞吃有机废物，促进土壤有机物质的矿化。蚯蚓利用其特有的生理功能及其与环境中微生物的协同作用对有机质进行生物降解，将废弃物中碳、氮、磷、钾等养分转化为更利于植物吸收的形态，增强微生物多样性，降低后续处置难度[9,10]。韩清鹏等发现，蚯蚓活动能够提高不同土壤中氮素矿化量[11]；俞协治等[12]发现，蚯蚓活动可以提升植物地上部分生物量，在一定条件下，能够影响部分重金属的有效性，间接影响植物对土壤重金属的吸收，降低重金属危害。

除蚯蚓自身作用外，蚯蚓粪在土壤修复方面也有巨大应用潜力。蚯蚓粪富含有机质和腐殖酸，可以增强地力，减少化肥施用，改良土壤板结；蚯蚓粪富含微生物菌群，对土壤的形成发育、物质循环和肥力演变等均有重大影响；蚯蚓粪中的几丁质酶产生菌，能够有效抑制植物性致病真菌[13]，有利于植物生长。有研究发现，蚯蚓粪可以通过提高叶绿素含量来有效地激活作物的光合作用，从而克服壬基酚胁迫对植物生长的影响。因此，蚯蚓粪除了降低土壤壬基酚的生物有效性外，还可以通过增强作物的抗逆性来帮助作物应对壬基酚胁迫[14]。张烨、周东兴[15,16]等发现，蚯蚓粪施加可以促进植物生长，提高农作物产量，并显著增加土壤肥力。

3 蚯蚓个体对土壤污染物的响应

蚯蚓对污染物较为敏感，当污染物浓度达到一定程度时，蚯蚓会出现明显的回避现象。徐冬梅等[17]发现，蚯蚓对有机污染物与重金属均会出现回避行为，且回避率与污染物浓度呈正相关。此外，蚯蚓的生长繁殖也会受到污染物影响而产生变化，有研究发现，重金属会导致蚯蚓体表溃烂[18]，且蚯蚓病变程度与重金属含量息息相关。还有研究发现，环境中重金属与有机污染物会使蚯蚓体重有较大程度下降[19,20]，不仅如此，污染物还会对蚯蚓生殖产生较大影响，使蚯蚓产茧量减少[21]，蚯蚓精细胞DNA损伤，精子畸形，并会导致前列腺、雄孔等器官病变[22]。故而，可以通过观测蚯蚓生理行为指标的变化来评价污染物对生态环境的毒害程度。

4 蚯蚓微观指标对污染物的响应

外源污染物对蚯蚓微观指标的影响是当前研究的热点，由于污染物生物有效性会随土壤性质变化而变化，而生物对污染物产生的生理、生化反应相对稳定。因此，利用生物的生理、生化反应可以指示污染物在个体水平上对生物的危害，本文主要介绍下面4种微观指标对污染物的响应。

4.1 蚯蚓体内酶对污染物的响应

污染物对蚯蚓酶影响的研究主要集中在重金属对抗氧化酶系统的影响方面，抗氧化酶系统对重金属较为敏感，其活性变化可以很好地反应重金属的存在状况。王辉等[23]发现，蚯蚓体内酶活性与重金属含量及处理时间关系密切，当重金属胁迫作用较低时，酶活性会因重金属胁迫上升，但是重金属胁迫过强，会对酶活性产生抑制作用。可以将抗氧化酶系统对环境污染物的胁迫反应用以指示污染物对环境的毒性效应。

4.2 蚯蚓DNA对污染物的响应

DNA作为生物体最重要的遗传物质，其稳定性至关重要，DNA具有一定的自我修复能力，但是当外界对DNA伤害过大时，会导致DNA损伤，影响其结构和功能，进而影响生物生存生长状况[24]。有研究发现[25]，邻苯二甲酸二乙酯会导致蚯蚓DNA损伤。王作彬[26]发现，杀虫剂作用导致蚯蚓体腔细胞DNA受到损伤，且DNA损伤程度与杀虫剂浓度间存在明显的“浓度—效应”关系。

4.3 蚯蚓溶酶体膜对污染物的响应

溶酶体主要存在于蚯蚓体腔细胞内，而中性红染料可以在其中积累富集，一旦溶酶体膜受到损害，中性红就会渗透到细胞质中，导致细胞变色。因此，可以用中性红染料保留时间来表征溶酶体膜稳定性[27]。武道吉等[28]发现，当蚯蚓受到砷污染时，其溶酶体膜稳定性下降，且溶酶体膜损害程度与砷浓度呈很好的线性关系。故而可用溶酶体膜稳定性来表征污染物毒性效应。

4.4 金属硫蛋白对污染物的响应

金属硫蛋白(MTs)是细胞内低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质。在真核生物中普遍存在的金属硫蛋白具有独特的结构特征，能提供强大的金属结合和氧化还原能力，保护生物体免受有毒金属的危害[29]。李超民等[30]研究表明，重金属胁迫会使蚯蚓体内金属硫蛋白含量显著增加，但是重金属浓度过高，会降低金属硫蛋白的含量。

5 展望

蚯蚓作为“生态系统工程师”，其在生态毒理试验中的应用对改良土壤污染、指示土壤污染状况、揭示污染物作用机理等方面具有重要意义。目前，土壤污染问题愈加严重，污染物更加复杂，着重于污染物的复合污染，迁移、污染物累计动态过程等研究对于土壤污染的缓解有重大意义。同时，重点挖掘蚯蚓生物标志物对土壤污染的早期预警作用，蚯蚓对污染土壤的改良作用也将为缓解土壤污染情况贡献力量。