高敏HBV DNA及HBsAg定量对低病毒载量慢性乙型肝炎的临床价值

张小曼 何彩婷 张纯瑜 许正锯

近年来，国内外各版CHB防治指南均推荐采用HBV DNA检测下限(10～12 IU/mL)判断治疗终点[1-5]。但目前多数检测方法的下限仍为HBV DNA<500 IU/mL，已不能满足临床诊疗需求。本研究利用高敏HBV DNA检测技术，检测下限为20 IU/mL，同时结合HBsAg定量、HBeAg、ALT、GP73等指标分析其与高敏HBV DNA的关联性，以期进一步探讨高敏HBV DNA的临床应用价值，为临床诊疗提供帮助。

资料与方法

一、临床资料

收集2018年4月至2019年10月就诊于解放军联勤保障部队第910医院肝病中心CHB患者654例。其中男性525例，女性129例，年龄为40(8～82)岁，以30～49岁患者为主，占61.31%(401/654)。对其中的427例高敏HBV DNA<500 IU/mL的患者抗病毒治疗史进行了随访：分为未治疗(49例)、≤1年(78例)、1～2年(58例)、2～3年(75例)、>3年(167例)。纳入病例的诊断标准均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[1]。排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病、其他嗜肝病毒及环境因素引起的肝功能损伤患者。标本均为新鲜分离血清，-80 ℃保存、整批待检。所有患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

二、研究方法

HBsAg、HBeAg采用罗氏e601全自动电化学发光分析仪检测； GP73测定，按照北京热景生物技术公司提供的GP73酶联免疫定量检测试剂盒说明书操作，酶标仪采用美国Biorad-860检测GP73反应板吸光度；ALT测定采用美国贝克曼(Beckman Coulter)AU680全自动生化分析仪；高敏HBV DNA定量采用湖南圣湘生物科技有限公司提供的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，采用Natch S全自动核酸提取仪(湖南圣湘生物科技有限公司)提取血清HBV DNA，采用SLAN-96P PCR扩增仪(上海宏石医疗科技有限公司)进行实时荧光定量检测。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0、MedCalc 15.6软件进行统计分析。HBsAg呈偏态分布，采用中位数(四分位间距)表示，其他指标采用分类计数频数统计。HBsAg组间比较采用多个独立样本的秩和检验(Kruskal Wall Test)；分类计数资料组间比较采用Pearson卡方检验；临床指标与高敏HBV DNA相关性采用曲线估计(Curve Estimation)方法中的曲线相关拟合方式，选取相关系数较大的拟合曲线作为相关模型，并进行F检验；临床指标与治疗时间趋势相关性采用Cochram Armitage趋势检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同HBV DNA载量的CHB患者临床指标比较

ALT、GP73异常率、HBeAg阳性率及HBsAg含量在不同HBV DNA载量水平间均差异有统计学意义(均P<0.01)，如表1所示。

二、临床指标与阳性高敏HBV DNA相关性

654例CHB患者中，高敏HBV DNA阳性的有402例，HBsAg和高敏HBV DNA同时阳性的有401例，各临床指标与阳性高敏HBV DNA的相关关系如下：ALT与阳性高敏HBV DNA存在幂函数相关性，相关系数为0.394，差异有统计学意义(F=73.693，P<0.01)；GP73与阳性高敏HBV DNA存在Logistic相关关系，相关系数为0.369，差异有统计学意义(F=51.230，P<0.01)；HBsAg与阳性高敏HBV DNA存在抛物线函数相关关系，相关系数为0.415，差异有统计学意义(F=45.183，P<0. 01)。

表1 不同HBV DNA载量CHB患者临床指标比较[例数(%)]

三、低载量HBV DNA的CHB患者肝功能异常情况

将427例HBV DNA<500 IU/mL HBV感染者分为高敏阴性组(<20 IU/mL)和高敏阳性组(20～499 IU/mL)。根据HBeAg状态进一步分析患者功能损害情况，如表2所示。HBeAg(+)组中，高敏阴性与高敏阳性组ALT、GP73异常率差异均无统计学意义(χ2=1.440、0.371，均P>0.05)。但在HBeAg(-)组中，高敏阳性患者ALT异常率高于高敏阴性组，差异均有统计学意义(χ2=7.174，P=0.007)，但GP73异常率在两组间差异无统计学意义(χ2=3.467，P=0.063)。

四、治疗时间与高敏HBV DNA<500 IU/mL患者HBV DNA阳性率及临床指标相关性

427例HBV DNA<500 IU/mL患者按治疗时间分为未治疗、治疗1年内、治疗1～2年、治疗2～3年、治疗大于3年，其高敏HBV DNA阳性率分别为46.94%、44.87%、24.14%、34.67%、25.75%。采用Cochram Armitage趋势检验判断治疗时间与高敏HBV DNA及临床指标间是否存在线性趋势，结果显示高敏HBV DNA、ALT异常率与治疗时间均存在显著负相关(χ2=10.723、13.021，均P<0.01)；GP73异常率、HBeAg 阳性率与治疗时间无相关性(χ2=6.494、0.814，均P>0.05)。见表3。

采用Pearson卡方检验，未治疗组ALT异常率与治疗时间为1～2年、2～3年、大于3年均差异有统计学意义(χ2=5.138、6.918、11.730，P=0.023、0.009、0.001)。另外，随着治疗时间延长，ALT异常患者中HBV DNA阳性率分别为69.56%(16/23)、42.31%(11/26)、35.71%(5/14)、29.41%(5/17)、31.43%(11/35)。采用Pearson卡方检验，5组差异有统计学意义(χ2=10.128，P=0.038)。两两比较后发现未治疗组ALT异常患者中HBV DNA阳性率与2～3年、>3年组差异有统计学意义(χ2=4.812、6.653，P=0.028、0.010)。

表2 427例高敏HBV DNA<500 IU/mL患者HBeAg状态与临床指标异常率分析[例数(%)]

表3 427例HBV DNA<500 IU/mL患者治疗时间与临床指标异常率分析[例数(%)]

讨 论

ALT是反映肝细胞早期损伤敏感的指标[6-7]，GP73近来被认为与慢性HBV感染者肝脏炎症损伤关系密切[8-11]。大多学者认为，病毒的持续复制会伴随肝细胞损伤，从而引起ALT、GP73等水平升高[12-15]。但也有学者认为，ALT、GP73水平升高与HBV活跃复制无关[8]。以上这些研究者的报道大多采用的是传统的HBV DNA检测，忽略了病毒在低复制程度时的表达差异。本文中，ALT、GP73异常率在不同HBV DNA病毒量分组中并未随病毒量升高而升高。在>2 000 IU/mL组，ALT、GP73异常率均为最高，但在病毒中低程度复制时，ALT、GP73异常率差异均不显著。而相关性分析表明，ALT、GP73含量与阳性高敏HBV DNA病毒量均呈显著曲线相关。提示ALT、GP73虽然与HBV DNA病毒量存在一定的关联性，但在病毒高水平复制时，引起的ALT、GP73异常表达才较为明显。在病毒复制程度较低时，ALT、GP73水平的异常升高不能准确反映患者体内病毒复制水平。

传统认为HBsAg(+)、HBeAg(+)提示HBV复制活跃、传染性强，而HBsAg、HBeAg转阴，抗-HBs、抗-HBe出现是机体清除病毒的标志[16]。近年来，将HBsAg水平定量作为CHB患者抗病毒疗效监测指标引起越来越多学者的关注[17-19]。本文中，HBeAg阳性率、HBsAg含量随HBV DNA病毒量升高而升高，但在病毒低水平复制时，HBeAg阳性率无差异，HBsAg定量却相反。另外，HBsAg含量与HBV DNA病毒量的相关性与其他临床指标相比最好。这些结果提示，无论是在病毒高水平复制时，还是低水平复制时，HBsAg水平的变化与HBV DNA水平均有较好的关联性。值得注意的是，252例HBV DNA<20 IU/mL的患者中，242例HBsAg阳性。这表明，HBsAg的清除与HBV DNA消失并不平行。将HBsAg定量结合高灵敏度HBV DNA检测才能更好地评估患者病毒复制状态及抗病毒疗效。

目前国内HBV DNA定量检测下限多为<500 IU/mL，但很多患者体内的病毒复制仍在持续，由此引起的肝损伤也常被忽略。本研究中，HBV DNA<500 IU/mL患者高敏HBV DNA阳性的占40.98%，且这部分阳性HBV DNA患者的ALT阳性率显著高于<20 IU/mL患者，但在HBeAg阳性时，这种差异不明显。金速速等[20]报道，HBeAg阳性和阴性组HBV DNA病毒量为30～500 IU/mL患者ALT异常率均高于<30 IU/mL患者。而李敏伟[21]认为，不同HBV DNA组内HBeAg阳性和阴性组间ALT异常率无差异，这些不同观点可能源于标本来源的差异性。但需要注意的是HBeAg阴性并不总意味着病毒复制减弱或消失，多数HBeAg阴性CHB患者HBV DNA复制水平减弱在103～104IU/mL，少数患者体内仍在进行不同程度的病毒复制[22]。而HBeAg阴性时病毒复制水平的加强由此引发的肝损伤可能与免疫逃逸相关：HBV迫于机体的免疫压力发生免疫突变，从而产生免疫逃避。这使肝细胞HBcAg表达增强，激发了T细胞对HBV的免疫反应引起病理损害，致使ALT表达升高[23]。

HBV DNA<500 IU/mL患者的抗病毒治疗由于定量检测方法所限也常被忽略，针对<500 IU/mL患者，未治疗组ALT异常率显著高于有经过抗病毒治疗的各组别，且未治疗组ALT异常患者中HBV DNA阳性率为69.56%。未治疗患者体内病毒持续低水平复制可能是引起肝功能炎症损伤的主因。随着治疗时间延长，传统PCR法检测下限患者的HBV DNA阳性率、ALT异常率与治疗时间均存在显著负性趋势相关，另外，ALT异常率在治疗时间大于1年后的各分组中均显著低于未治疗组，且治疗时间2～3年、>3年组ALT异常患者中的HBV DNA阳性率也低于未治疗组。这些结果提示，通过抗病毒治疗，由于病毒持续低水平复制引起的患者肝脏炎症损伤状态相比未治疗组得到了显著改善。

综上所述，ALT、GP73、HBeAg虽然能在一定程度上反映HBV复制程度，但在病毒低水平复制时(<2 000 IU/mL)，ALT、GP73、HBeAg的评估价值均不理想。相对的，HBsAg与HBV DNA病毒量有较好的关联性，但由于HBsAg的清除与HBV DNA复制减弱有时候并不平行，将HBsAg含量与高灵敏度HBV DNA检测值相结合，才能更好评估患者的抗病毒治疗效果。另外，针对HBVDNA<500 IU/mL者，持续监测患者高敏HBV DNA，对于降低患者肝损伤，延缓疾病进展有重要意义。