基于分子对接技术筛选木姜子属阿朴菲型生物碱的COX-2抑制剂研究(Ⅱ)

薛孟祺，汪欣怡，夏侯真如，夏绫誉，杨 平，杨念琦，张菊玉，汪云松，文政琦，杨靖华

(1.云南大学 化学科学与工程学院，教育部自然资源药物化学重点实验室，云南 昆明 650091;2.昆明医科大学 基础医学院，云南 昆明 650500； 3.昆明市妇幼保健院 孕产保健部，云南 昆明 650031;4.昆明医科大学 第一附属医院，云南 昆明 650500)

木姜子(Litsea)是樟科(Lauraceae)植物中的一个大属，据统计全球有200余种.我国有该属植物72种，其中47种为我国特有[1].木姜子属植物有着极高的药用价值，在古代，我国民间就有使用木姜子治疗炎症类疾病的记载.如豹皮樟对腰酸腿痛、风湿性关节痛有较好疗效；山鸡椒有祛风止寒，消肿化瘀的功效[2].

现今，炎症类疾病的发病机制已被现代药理学所揭示.一个经典的炎症反应包含4部分组件：炎症诱导物；传感器；炎症介质以及炎症目标组织.由炎症诱导物激活传感器释放炎症介质作用于靶组织从而产生炎症反应.炎症的介质可以有细胞因子，类花生四烯酸和蛋白水解级联产物等[3].其中，通过阻断类花生四烯酸类炎症介质进而切断炎性反应通路的方法已经取得了成功，诞生了如塞来昔布以及艾瑞昔布等一系列选择性环氧合酶抑制剂.

由炎症诱导物的刺激，细胞膜上的磷脂在磷脂酶A2(PLA2)的作用下转化为花生四烯酸(AA).AA在环氧合酶(COX)的作用下产生前列腺素H2(PGH2).COX具有2种同工酶，COX-1与COX-2，其中COX-1是1种正常的结构酶，在体内的所有组织中均有分布，维持机体的正常运转.而COX-2只在炎症组织中特异性表达[4].COX生成的PGH2又在组织异构酶的参与下转化为不同的结构，从而作用于不同的组织与器官[5].塞来昔布以及艾瑞昔布等药物正是特异性地作用于COX-2，阻止前列腺素(PGS)的形成，从而切断炎症通路.但近来报道，这些药物存在严重的心血管副作用，已经导致了罗非昔布与依托昔布的退市[6].目前急需开发新型的COX-2抑制剂.

阿朴菲生物碱是木姜子属植物的特征性成分之一[7，11].已有研究报道一些阿朴菲型生物碱对小鼠爪水肿模型具有抗炎与止痛功效[8-9].木姜子属阿朴菲生物碱与COX-2的对接研究未见报道，文中对来自木姜子属的34个阿朴菲生物碱采用分子对接技术展开研究，利用分子对接软件Molegro Virtual Docker 6.0(MVD)分析其对接得分以及分子与蛋白之间的相互作用关系，来探究分子与蛋白之间的构效关系，研究木姜子属抗炎的物质基础和作用机制，为新型药物的研发提供参考.

1 材料与方法

1.1 阿朴菲生物碱的分类

将34个已报道木姜子属阿朴菲生物碱进行分组，依据N原子上连接取代基的不同，分为7种结构类型，结构如图1.为了方便研究，实际分组时，分为5类，见图2～6.

图1 阿朴菲生物碱结构分类

图2 N-CH3型阿朴菲生物碱

图3 N-COOMe型阿朴菲生物碱

图5 带电荷双取代型阿朴菲生物碱

图6 N-乙酰基与N-烯丙基型阿朴菲生物碱

1.2 分子对接

1.2.1 受体蛋白的构建

COX-2蛋白从PDB数据库下载，ID为6COX[10].该蛋白由2个相同的二聚体组成，首先将其导入Molegro Virtual Docker 6.0软件，采用CHARMm力场优化蛋白结构，除去水分子，只保留蛋白的B链，去除多余配体，保存为mol2格式备用.

1.2.2 配体库的构建

将34个阿朴菲生物碱采用ChemDraw 2014软件绘制其2D结构[11]，导入Chem3D 2014软件中，采用MMFF94算法计算出化合物的最低能量构型，将最大迭代次数设置为 5 000，最大RMS梯度设置为0.5.将设置好的3D结构保存为mol2格式备用.

1.2.3 对接方法确定

采用之前确定的对接方法，打分函数采用Moldock Score，搜索算法为Moldock SE，调整对接腔半径为12，每个化合物对接计算15次，输出得分最高的前3个结果.在重现蛋白原配体时的RMSD为1.164，小于2，说明对接方法可以使用[12].为了确保对接结果的可靠性，取3次打分结果的平均值作为每个化合物的最终得分，并将艾瑞昔布(A)作为阳性对照.

2 实验结果与讨论

2.1 N-CH3 型阿朴菲生物碱构效关系研究

N-CH3型阿朴菲生物碱打分结果如下表所示.无甲氧基取代以及单甲氧基取代的阿朴菲生物碱得分接近，将其放在一起对比.根据打分结果，可以观察到1个明显的趋势，即无甲氧基取带的阿朴菲生物碱与一甲氧基取代的阿朴菲生物碱得分最高，随甲氧基数量的增加，分子得分逐步降低.

表1 N-CH3型阿朴菲生物碱打分结果

N-CH3型阿朴菲生物碱分子与COX-2的对接研究，揭示了下述研究结果：

1) 从图7的对接结果可以发现，1，2与4的双氧环结构可以与蛋白形成1～2个氢键，分子上的羟基也易于形成氢键.并且2上的N原子也可以与氨基酸残基形成氢键.

图7 无甲氧基与一甲氧基取代N-CH3阿朴菲生物碱与COX-2二维相互作用

2) 当二甲氧基取代时，打分较单甲氧基型下降.通过对对接结果的观察可以发现，5与6的得分最低，它们基本不与蛋白产生氢键作用.而7与9的得分较5与6显著增加，分子与蛋白之间也能产生较多的氢键作用.它们的区别在于5与6的4个取代基位置为R3，R4，R6和R7，而7与9的取代位点为R3，R4，R5和R6.由此推测当取代基在环上的位置集中在一起时，有利于蛋白与阿朴菲生物碱之间的氢键作用从而使得相互作用增强.

3) 通过观察8的对接情况发现虽然其也存在双氧环结构，但对接得分较低，从8的相互作用图中可以发现该分子为R6，R7双甲氧基取代，R6位上的甲氧基出现了非常明显的红色区域，这表示处于该区域的结构对于对接的贡献为负，这一结果说明在R6与R7位上同时出现甲氧基对于分子蛋白相互作用不利.

4)10与5和6具有类似的结构，但其对接得分却远高于5与6.通过观察发现10在R9位上存在1个羰基，该羰基可以与Tyr355形成氢键作用，推断该羰基使对接得分提高.

5)11与12的对接情况和14与16的对接结果对比，验证了之前的结论，即当取代基在环上的位置集中(即在R3，R4，R5，R6上取代)时，有利于蛋白与阿朴菲生物碱之间的氢键作用从而使得相互作用增强.

6) 分子15上存在5个取代位点，其结构相比于11和12在R7位上多了1个取代基，导致了对接得分的降低，通过与前面对接结构的综合比较可以得知阿朴菲分子中存在3个或4个取代基相比于5个取代基来说与蛋白结合更为有利.

7)17的对接结果验证了之前R6与R7位同时被甲氧基取代不利于分子与蛋白相互作用的结论.

2.2 N-COOMe型阿朴菲构效关系研究

表2 N-COOMe型阿朴菲生物碱打分结果

N-COOMe型阿朴菲分子与COX-2的对接研究，揭示了下述研究结果：

1) 通过总体观察，N-COOMe型阿朴菲生物碱得分总体低于N-CH3型.从对接结果图中可以观察到酯基上存在红色区域，不利于分子与蛋白相互作用.但也存在与N-CH3型阿朴菲生物碱相同的规律，即甲氧基的数量越少，蛋白与分子结合更为有利.

2) 分子18与23中R5与R8位上的2个羰基有助于氢键的形成，并且18中R3与R4位存在双氧环结构也有利于对接，因此18的打分最高，23次之.

3) 从21与20,24的对接结果来看，R6与R7位同时存在甲氧基也对对接不利.

2.3 碳氮双键型阿朴菲构效关系研究

表3 碳氮双键型阿朴菲打分

碳氮双键型阿朴菲分子与COX-2的对接研究，揭示了下述研究结果：

图9 三甲氧基与四甲氧基N-CH3阿朴菲生物碱与COX-2二维相互作用

2.4 带电荷双取代型阿朴菲构效关系研究

表4 带电荷双取代型阿朴菲打分

带电荷双取代型阿朴菲分子与COX-2的对接研究，揭示了下述研究结果：

1) 从图12中可以看出相互作用中不存在离子键，N离子对于对接的影响可以忽略不记.从打分结果来看4个离子型阿朴菲对接结果均不理想，N上连接双取代基不利于对接.

2)29与甲基取代型7在结构上具有相似性，它们的R4与R5位上均是双羟基取代，再次证明该结构有利于形成氢键作用，对成键有利.

2.5 N-乙酰基与N-烯丙基型阿朴菲构效关系研究

图10 N-COOMe型阿朴菲与COX-2二维相互作用

图11 碳氮双键型阿朴菲与COX-2二维相互作用

图12 带电荷双取代型阿朴菲与COX-2二维相互作用

图13 33，34与COX-2二维相互作用

3 结语

通过分组对34个阿朴菲型生物碱与COX-2蛋白的对接研究中，揭示了一系列规律.

1) 分子对接的得分高低与甲氧基数量之间存在关系，随着甲氧基取代数量的增多，对接的得分会逐步降低.当阿朴菲中不含甲氧基或者只含有1个甲氧基时，对接得分最高.含4个甲氧基时得分最低.

2) 当在阿朴菲母核的R3，R4位或R6，R7位形成双氧五元环结构时，环上的2个氧原子易于和蛋白之间形成氢键，从而增加对接得分.

3) 甲氧基结构相比于双氧环结构以及羟基来说，较难与蛋白之间产生氢键作用，这也是为什么甲氧基的取代增加会导致对接得分降低的直接原因.并且，从以上相互作用图中可以得知，当R6与R7位同时被甲氧基占据时，阿朴菲与蛋白之间的匹配度会急剧降低，产生极低的得分.

4) 当在分子中引入羰基后，可以增加氢键作用的概率，提高得分，如在R3与R8以及R9位引入羰基.

5) 除羰基和N上的取代外，分子中3～4个位点的取代有较好的对接结果，如果增加取代基数量，则不利于与蛋白相互作用.并且当4个取代基的位置集中，即同时取代R3，R4，R5，R6 4个位点时，有利于分子与蛋白间的相互作用.最后，R3与R4位同时被羟基取代，有利于氢键的形成.

6) N上取代基的不同对对接得分有很大的影响，从结果统计来看，N上连接甲基，或者形成碳氮双键的结构得分最高，且打分数值相近.当连接乙酰基，烯丙基，酯基后得分变得很低.并且N上连接双取代基的分子打分也不理想，由此推断减小N上的位阻有利于分子与蛋白之间的相互作用，增大位阻则不利于相互作用.

此外，研究过程中我们还引入了阳性对照药物艾瑞昔布，通过对打分结果的统计，N-CH3型阿朴菲生物碱2的得分大于阳性对照，1与艾瑞昔布近似相同.含碳氮双键的阿朴菲生物碱25与26得分大于艾瑞昔布.这4个分子值得开展进一步的研究.

近年来研究表明COX-2除与炎症类疾病相关外,在血小板活化综合征、不稳定的心绞痛、严重的动脉粥样硬化疾病中，患者的PGI-M排泄增加[13-15]，而主要合成PGI-M的酶正是COX-2,除此之外，2型糖尿病、肥胖、神经退行性疾病，这些疾病能与慢性炎症起到相互协同的作用.比如肥胖可以诱发慢性炎症，而慢性炎症又可以反过来通过使胰岛素分泌减少从而促进肥胖型糖尿病的发生[16].在癌症与动脉粥样硬化等疾病中也有相似的作用.因此，抑制COX-2可以间接性的治疗这些与炎症相互协同的疾病.研究结果表明阿朴菲类生物碱具有较强的药用潜力，值得开展进一步的深入研究.