无柄灵芝子实体的化学成分研究

刘文星，杨桥芬，叶艳青

(云南民族大学 化学与环境学院，云南 昆明 650500)

灵芝Ganodermalucidum属于真菌门灵芝菌科灵芝属[1]，它具有补气安神、止咳平喘的功效，能治疗肺虚咳喘、心神不宁、失眠心悸、虚劳短气、不思饮食[2].灵芝含有三萜类、多糖、蛋白质、有机酸、氨基酸等各种成分，具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫等作用[2].灵芝的同属真菌无柄灵芝Ganodermaresinaceum可预防和治疗各类疾病，具有抗癌、保肝、增强免疫力等多种作用，它的化学成分复杂，主要有三萜、降三萜、杂萜、黄酮、甾体、多糖、喹诺酮、葡聚糖、混源萜等成分[3-11].本研究从无柄灵芝实体中得到了6个化合物，它们分别为lucidone I(1)、spiroapplanatumine L(2)、spiroapplanatumine M(3)、牛蒡苷(4)、applanatin A(5)和3-羧基吲哚(6)(见图1)，所有化合物均为首次从该真菌中分离得到.

图1 化合物1～6的结构

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Agilent-1200 型HPLC(Agilent)；DRX-400 型核磁共振仪(Bruker)；Venusil XBP-C18(10 mm×250 mm，5 μm)半制备色谱柱(美国 BIO-RAD)；YMC-Pack ODS-A(20 mm×250 mm，S-5 μm)制备色谱柱(美国BIO-RAD)；OSB-2100BS型旋转蒸发仪(日本EYELA).

1.2 材 料

200～300目硅胶(青岛海洋化工)；GF 254(50×100 mm)薄层色谱板(青岛海洋化工)；MCI-gel CHP-20P(75～150 μm)树脂(南京元宝峰医药科技)；10% H2SO4；分析纯乙腈、甲醇(天津天泰精细化学品有限公司)；工业级甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯；超纯水.

本实验所用的无柄灵芝G.resinaceum子实体原产地为云南瑞丽，2017年4月从昆明市菊花村药材交易市场购买，样品鉴定人：云南民族大学杨青松副教授.

2 提取分离

45 kg 的无柄灵芝G.resinaceum干燥后粉碎，用95%的乙醇加热回流提取2次，浓缩后用乙酸乙酯萃取，浓缩得到 1.0 kg 浸膏.浸膏用正相硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷∶甲醇(V/V)进行梯度洗脱(1∶0、70∶1、80∶2、80∶10、10∶2、0∶1)，得到6个(A～F)组分.

组分C(500.0 g)用正相硅胶柱层析分离，用二氯甲烷:甲醇梯度洗脱(1∶0、80∶2、100∶5、100∶10、100∶20、0∶1)，得到6个组分(C-1～C-6).用MCI柱层析分离C-3(48.9 g)，以体积分数32%、45%、60%、75%、95%的甲醇水洗脱剂来洗脱，然后用HPLC分离得到化合物2(4.0 mg)、5(21.0 mg)和化合物6(56.7 mg).

组分D(300.0 g)以二氯甲烷∶甲醇为洗脱剂(1∶0、70∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)，用正相硅胶柱层析梯度分离得到7个组分(D-1～D-7).D-2(62.5 g)用甲醇水作为洗脱剂，用反相柱色谱梯度洗脱，再用HPLC分离得到化合物1(80.0 mg).D-3(63.8 g)进行反相柱层析，用甲醇-水(体积分数为20%、30%、50%、70%、90%)洗脱，再用HPLC分离得到化合物3(52.2 mg)和化合物4(7.8 mg).

3 结构鉴定

化合物1黄色粉末，根据NMR数据推断其分子式为C24H34O4，不饱和度Ω = 8.1H NMR (Pyridin-d5,400 MHz)δ:2.89 (1H, m, H-1a), 1.29 (1H,m,H-1b),1.85～1.95(2H,m,H-2),3.41(1H,dd,J=5.1,11.0 Hz,H-3),1.85-1.95 (1H,m,H-5),2.68(1H,m,H-6a),2.37(1H,m,H-6b),3.10(1H,d,J=15.7 Hz,H-12a),2.82(1H, d,J=15.7 Hz,H-12b),2.89(1H,m,H-16a),1.53(1H,d,J=7.1 Hz,H-16b),2.34(1H,m,H-17),0.95(3H,s,H-18),1.34(3H,s,H-19),2.39(1H,m,H-20), 1.05 (3H, t-like,J= 5.7 Hz,H-21),1.12 (3H,s,H-28),1.03(3H,s,H-29),1.73(3H,s,H-30);13C NMR (Pyridin-d5,100 MHz)δ: 34.5(C-1),28.5(C-2),77.0(C-3),40.0(C-4),52.0(C-5),37.2 (C-6), 200.1(C-7),147.4(C-8),152.1(C-9),41.3(C-10),200.5(C-11),50.1(C-12),45.6(C-13),58.0(C-14),208.0(C-15),40.7(C-16),44.9(C-17),16.5(C-18),18.3(C-19),32.2(C-20),20.3(C-21),28.5(C-28),16.5(C-29),21.8(C-30).以上数据与文献[11]报道一致，鉴定化合物1为lucidone I.

化合物2黄色胶状物，根据NMR数据推断其分子式为C16H16O6，不饱和度Ω = 9.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:6.89 (1H, d,J= 2.6 Hz, H-3), 7.13 (1H, dd,J= 8.9, 2.6 Hz, H-5), 6.94 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-6), 3.29 (1H, d-like,J= 9.5 Hz, H-3′), 2.04～2.13 (4H, m, H-4′, H-5′), 3.00 (1H, dd,J= 6.6, 16.1 Hz, H-6′), 5.07 (1H, s, H-8′a), 5.07 (1H, s, H-8′b), 3.80 (2H, s, H-9′);13C NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 167.2 (C-1),123.3(C-2),107.9(C-3),153.7 (C-4), 128.1 (C-5),114.6 (C-6),205.1 (C-1′), 98.7 (C-2′), 53.9 (C-3′), 28.7(C-4′),30.7(C-5′),53.9(C-6′),146.2(C-7′),113.2(C-8′),65.4 (C-9′), 176.2(C-10′).以上数据与文献[12]对照一致，鉴定化合物2为spiroapplanatumine L.

化合物3黄色胶状物，根据NMR数据推断其分子式为C16H16O6，不饱和度Ω = 9.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:6.86 (1H, d,J= 2.7 Hz, H-3),7.12(1H,dd,J=8.9,2.7 Hz,H-5),6.92 (1H, d,J=8.9 Hz,H-6),3.29(1H, t-like,J=5.0 Hz,H-3′),2.02～2.14(4H,m,H-4′,H-5′),2.92(1H,dd,J=7.9,10.2 Hz,H-6′),5.05(1H,s,H-8′a), 5.05(1H,s,H-8′b),3.77(2H,s,H-9′);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ:167.2(C-1), 123.0(C-2),107.8(C-3),153.8(C-4),128.4(C-5),114.6(C-6),204.5(C-1′),98.2(C-2′),56.1(C-3′),27.8(C-4′),30.5(C-5′),53.9(C-6′),145.8(C-7′),113.5(C-8′),65.4(C-9′),174.4(C-10′).以上数据与文献[12]对照一致，鉴定化合物3为spiroapplanatumine M.

化合物4白色粉末，根据NMR数据推断其分子式为C27H34O11，不饱和度Ω = 11.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ:6.73(1H, d,J=1.7 Hz,H-2), 7.05 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5),6.63(1H, dd,J= 1.6, 8.3 Hz, H-6),2.87 (2H, m, H-7),2.65 (1H, dd,J= 7.4, 13.2 Hz, H-8),6.57-6.68(1H, m, H-2′), 6.80 (1H, d,J= 8.6 Hz,H-5′), 6.58 (1H, d,J= 6.2 Hz, H-6′),2.63-2.68(1H, dd,J=7.4,13.2 Hz, H-7′a),2.50～2.54(1H, m, H-7′b),2.46(1H, dd,J= 7.7, 14.5 Hz, H-8′), 4.16 (1H, dd,J= 7.6, 8.6 Hz, H-9′a), 3.88 (1H, m, H-9′b), 4.87 (1H, s, glu), 3.66～3.92 (10H, m, glu), 3.77, 3.77, 3.73 (9H, s, OMe);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ: 134.2 (C-1),113.5 (C-2),150.5 (C-3),149.1 (C-4),117.7 (C-5),122.0 (C-6), 33.3 (C-7), 45.6 (C-8), 181.3 (C-9), 132.6 (C-1′), 114.7 (C-2′), 150.4 (C-3′), 146.7 (C-4′), 112.8 (C-5′), 122.9 (C-6′),36.7 (C-7′), 40.4 (C-8′), 72.9 (C-9′), 102.8 (C-1″), 74.8 (C-2″), 77.7 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.1 (C-5″), 62.4 (C-6″), 56.8, 56.5, 56.4 (OMe).以上数据与文献[13]对照一致，鉴定化合物4为牛蒡苷(arctiin).

化合物5无定型粉末，根据NMR数据推断其分子式为C16H16O6，不饱和度Ω = 9.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 3.16 (1H, brs-like, H-2), 6.75 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-5), 7.00 (1H, dd,J= 8.7, 1.8 Hz, H-7), 6.80 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-8), 1.94 (2H, m, H-10), 1.92 (1H, m, H-11), 2.83 (1H, m, H-12), 4.90 (1H, m, H-15a), 4.82 (1H, m, H-15b), 3.66 (1H, s, H-16);13C NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 98.6 (C-1), 57.3 (C-2), 204.7 (C-3), 123.1 (C-4), 107.9 (C-5), 167.1 (C-6), 128.2 (C-7), 114.6 (C-8), 153.6 (C-9), 28.1 (C-10), 30.6 (C-11), 53.8 (C-12), 204.9 (C-13), 146.0 (C-14), 113.3 (C-15), 65.4 (C-16).以上数据与文献[14]对照一致，鉴定化合物5为applanatin A.

化合物6黄绿色结晶，根据NMR数据推断其分子式为C9H7NO2，不饱和度Ω = 7.1H NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 7.92 (1H, s, H-2), 8.04 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-5), 7.16 (2H, m, H-6, H-7), 7.41 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-8);13C NMR (CD3OD,100 MHz)δ: 133.4 (C-2), 127.5 (C-3), 108.9 (C-4), 123.6 (C-5), 122.0 (C-6), 122.4 (C-7), 112.9 (C-8), 138.2 (C-9), 169.3 (C-10).以上数据与文献[15]对照一致，鉴定化合物6为3-羧基吲哚(1H-indole-3-carbaldehyde).

4 结语

本实验对无柄灵芝G.resinaceum子实体的95%乙醇提取物通过正相柱色谱、反相柱色谱、MCI柱色谱以及半制备HPLC等技术手段进行了化学成分研究，得到了6个化合物(lucidone I(1)、spiroapplanatumine L(2)、spiroapplanatumine M(3)、牛蒡苷(4)、applanatin A(5)和3-羧基吲哚(6))，它们的结构通过核磁共振技术(1H NMR、13C NMR)进行了鉴定，所有化合物均为首次从该大型真菌中分离得到.本研究为进一步开发无柄灵芝提供了物质基础和有益的借鉴.