超声波辅助法提取南非叶多酚的工艺研究

陈文娟，韩 颖，陈建福

(1.漳州城市职业学院 食品工程系，福建漳州363000;2.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院 陕西 西安 710062;3.漳州职业技术学院 食品工程学院，福建 漳州363000)

南非叶(VernoniaamygdalinaDel)又名神奇叶、苦茶叶、桃叶斑鸠菊等，在我国又被称为“将军叶”，属于灌木类或小乔木类植物[1].南非叶生长能力强，四季皆宜种，简单扦插法即可成活，是一种极具药理研究价值的植物，在非洲被当做一种蔬菜，常应用于日常保健[2-3].南非叶富含黄酮、生物碱、多酚、倍半萜类等多种天然有效成分，能起到清血、凉血的作用，同时具有降血糖、血脂及抗氧化等多种生理功能[4].植物多酚是一种存在于植物的叶、根、皮、果实中的一种多羟基酚类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抑制心血管疾病、调血脂和降血糖等多方面的生理功能[5-6].为提高南非叶资源的利用率，以南非叶为原料，选用超声波辅助法提取其中的多酚，对液料比、乙醇浓度、超声时间和超声温度进行单因素实验，并结合响应面实验对工艺条件进行优化，确定了最佳的提取工艺，为南非叶资源的开发提供新的方向.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南非叶，采于漳州马鞍山.将采摘的南非叶用清水洗净，去除泥沙，晒干表面水分，置于 50 ℃ 鼓风干燥箱中烘干，粉碎成细粉末备用.福林酚试剂，自制；没食子酸(分析纯，天津瑞金物理化学品有限公司)；乙醇(食品医药级，河南省浩宇食品添加剂有限公司)；其它所用试剂均为分析纯.

提取过程使用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-100DE型数控超声波清洗器；吸光光度测试过程使用上海市美普达仪器有限公司生产的UV-200型可见/紫外分光光度计.

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作

采用福林-酚法[7]，向7个 10 mL 容量瓶中移取质量浓度为 0.1 mg/mL 没食子酸标准溶液，体积依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、和 1.2 mL，再将 0.5 mL 福林-酚试剂顺次加入，缓慢混匀，静置约 1 min，再向各容量瓶移入 1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，定容至 10 mL，用试管架固定于水浴锅中，在 75 ℃ 反应 10 min，取出冷却后，使用预先设置波长为 765 nm 的分光光度计中测定吸光度值.以没食子酸浓度(mg/L)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线得y= 0.102 3x-0.029 7，R2=0.999 2.

1.2.2 南非叶多酚的提取及含量的测定

准确称量 1.000 0 g 的南非叶粉末，缓慢放入 100 mL 圆底烧瓶，加入一定量乙醇(体积分数)，按规定时间在超声波仪器中进行提取，提取完成后，静置至冷却.过滤、定容，后取 1 mL 提取液，按1.2.1中方法，测定吸光度.

多酚提取率(mg/g)= (C×N×V)/M

式中：C为南非叶多酚质量浓度(mg/L)；V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；M为南非叶质量(g).

1.2.3 单因素实验方法

准确称取 1.000 0 g 的南非叶粉末，缓慢装入 100 mL 的圆底烧瓶中，加入 30 mL 65%的乙醇，在 60 ℃ 的超声波仪器中分别浸提20、25、30、35和 40 min，取出烧瓶，静置至冷却，定容，研究对南非叶多酚提取率的影响，确定最佳超声时间.

准确称取 1.000 0 g 的南非叶粉末，缓慢装入 100 mL 的圆底烧瓶中，加入 30 mL 乙醇，乙醇体积分数分别为55%、60%、65%、70%和75%，设置超声温度 60 ℃，固定烧瓶，浸提 30 min，取出，静置至冷却，定容，研究不同乙醇浓度下对南非叶多酚提取率的影响，确定最佳乙醇体积分数.

准确称取 1.000 0 g 的南非叶粉末，缓慢装入 100 mL 的圆底烧瓶中，分别加入20、25、30、35和 40 mL 体积分数65%的乙醇溶液，设置超声温度 60 ℃，固定烧瓶，浸提 30 min，取出，静置至冷却，定容，研究不同液料比对南非叶多酚提取率的影响，确定最佳液料比.

准确称取 1.000 0 g 的南非叶粉末，缓慢装入 100 mL 的圆底烧瓶中，加入 30 mL 体积分数65%的乙醇，分别在55、60、65、70和75 ℃ 的超声波仪器中浸提 30 min，取出，静置至冷却，使定容，研究不同超声温度对南非叶多酚提取率的影响，确定最佳超声温度.

1.2.4 响应面优化设计

准确称取 1.000 0 g 南非叶粉末，在液料比、乙醇体积分数、超声时间和超声温度4个单因条件下(表1)，确定每个提取因素的变化范围，得到各因素的适应值.在此基础上，采用Box-Behnken Design软件，根据设计原理，各自变量选取3个水平，采用-1、0、1进行编码，以南非叶多酚提取率为响应值，设计实验方案.

表1 响应面分析各因素与水平

2 结果与分析

2.1 南非叶多酚提取率的影响因素

2.1.1 液料比对南非叶多酚提取率的影响

由图1中可知，当液料比上升至 30 mL/g 时，南非叶多酚的提取率处于最高点，这是由于随着液料比的升高，南非叶多酚提取系统中溶剂含量增加，促使提取过程传质推动力增大，进而提取率增大，但当液料比超过 30 mL/g 后，溶剂过多，导致增大了过滤等操作中多酚含量的损失[8]，造成提取率下降，由此选择液料比 30 mL/g 为宜.

图1 液料比对南非叶多酚提取率的影响

2.1.2 乙醇浓度对南非叶多酚提取率的影响

由图2可知，当乙醇浓度上升到65%时，南非叶多酚提取率处于最高点，这是由于在植物体内，氢键通常作为多酚类物质与蛋白质、多糖等结合的桥梁，随乙醇浓度的提高，氢键断裂加速，多酚在乙醇中的溶解度增加，导致提取率增大[9].但当乙醇浓度超过65%后，溶剂极性被减弱，南非叶粉末中多酚类物质受醇溶性杂质影响，溶出被抑制，造成多酚提取率下降，由此选择乙醇浓度65%为宜.

2.1.3 超声时间对南非叶多酚提取率的影响

由图3可知，当超声时间延长到 30 min 时，南非叶多酚提取率处于最高点，这是由于液料接触时间越长越利于南非叶中多酚的溶出，但当超声时间超过 30 min 时，继续延长超声时间，多酚物质易被氧化破坏，最终结果为提取率下降，故超声时间选取 30 min 为宜.

图3 超声时间对南非叶多酚提取率的影响

2.1.4 超声温度对南非叶多酚提取率的影响

由图4可知，当超声温度上升到 60 ℃ 时，南非叶多酚提取率达到峰值，这是由于伴随温度升高，提取系统中分子运动平均自由程增大，加速南非叶粉末中多酚类物质溶出，多酚提取率增大，但当超声温度超过 60 ℃时，系统温度过高，多酚分子受到氧化破坏，使得多酚提取率下降[10]，由此得最佳提取温度为 60 ℃.

2.2 南非叶多酚提取的响应面分析

2.2.1 响应面设计及结果

以南非叶多酚提取率为响应值，采用Design Expert 8.05b软件，分析试验设计的Box-Behnken 设计方案，结果与方差结果如表2、表3所示.

表2 Box-Behnken试验设计 mg/g

续表

表3 回归方程方差分析

依据表2，选用液料比(A)、乙醇浓度(B)、超声时间(C)和超声温度(D)作为自变量，以南非叶多酚提取率(Y)为响应值，建立四元二次回归模型：

Y=20.32-0.027A-0.041B+0.076C-0.30D-0.12AB-0.052AC-0.47AD-0.1BC+0.47BD-0.22 CD -1.57A2-1.16B2-0.5C2-0.81D2

通过对南非叶多酚提取所得数学模型进行方差分析，以检验所得试验方程的可靠性与有效性.表3显示，南非叶多酚提取率为响应值时，回归模型极显著(p<0.000 1)；同时失拟度(p= 0.211 5)，说明回归方程失拟项检验不显著，证明其余的未知因素对结果影响非常小.相关系数R2= 0.909 2，表明该二次模型方程反映的试验值具有较好的可靠性与真实性.所得模型方程与实际情况拟合较好，能够清晰的反映南非叶多酚提取率同4个因素间的关系，从而可证明该四元二次回归方程能够较好的预测南非叶多酚提取率如何随各因素的变化而变化.

由表3中不同模型的P值得，除二次项A2、B2、C2、D2影响差异极显著，一次项D与交互项AD、BD为显著，其余项影响差异均不显著.说明在单因素中，超声温度是南非叶多酚提取率的主要影响因素，液料比的影响最弱.各交互作用中，乙醇浓度与超声温度间交互作用最显著.由表3中F值得，南非多酚提取率受不同因素影响比为：超声温度>超声时间>乙醇浓度>液料比.综合以上各试验参数能够证明此试验方法的可靠性，故为了较真实的分析结果，可选择使用该回归模型.

2.2.3 响应面设计的曲面图分析

响应曲面图是响应值(多酚提取率)与A、B、C、D四因素之间关系绘制成的三维空间曲面图，观察各曲面图可得到各参数及最优参数间的相互作用.当特征值均为正且存在极小值时，响应曲面图为山谷形，当特征值均为负且存在极大值时，响应曲面图为山丘形，当特征值有正有负且无极值时，响应曲面图为马鞍形.同时据回归方程可得出各个因子的响应曲面图及相应的等值线图，从而分析各因素间的交互作用对南非叶多酚提取率效果的影响.采取Design Expert 8.05b软件，绘制出各交互作用的响应曲面图，如图5所示.

图5 各因素之间交互作用的影响

结合三维响应曲面与二维等高线可分析出几个自变量对响应值的影响情况，响应面图形的曲线越陡，等高线的椭圆形离心率越大，表明其交互效应越显著.由图5可得，液料比为定值时，适当提高超声温度有利于多酚的提取；当超声温度为定值时，多酚提取率随液料比增加逐渐增加，提取率在液料比为 35 mL/g 时达到最大值，此时若再增大液料比，多酚提取率反而逐渐下降，从而得出两因素间交互作用显著.另外当乙醇浓度为定值时，在一定范围内提高超声温度引起多酚物质的溶出加快，但过高的温度会破坏多酚物质结构，导致提取率下降；当超声温度为定值时，随乙醇浓度增加，多酚提取率变化趋势为先升后降.超声温度在60～65 ℃ 时轴向的等高线较密集，则表明，乙醇浓浓度和超声温度间交互作用显著.其他交互作用对南非叶多酚提取率影响不显著(p>0.05)图略去.

2.2.4 最优工艺条件验证

通过响应面实验分析，得到提取南非叶多酚最佳工艺条件为：液料比为 30.13 mL/g，乙醇体积分数为64.64%，超声时间 30.66 min，超声温度为 58.84 ℃，理论预测提取率为 20.36 mg/g.为使操作便利，修正实验条件为：料液比 30 mL/g，乙醇体积分数65%，超声时间 31 min 和超声温度 59 ℃，在此条件下提取南非叶中多酚，得到的实际提取率为 20.33 mg/g，相比理论预测值 20.36 mg/g，算得相对误差仅为0.15%，表明该模型具有较好的可靠性与准确性，可为南非叶中多酚提取的实际操作提供参考.

3 结语

1) 以南非叶为原料，进行单因素试验，并通过响应面分析，得到影响南非叶多酚提取率的四元二次回归方程：

Y=20.32-0.027A-0.041B+0.076C-0.30D-0.12AB-0.052AC-0.47AD-0.1BC+0.47BD-0.22CD -1.57A2-1.16B2-0.5C2-0.81D2，该数据模型具有较高的准确度和可信度，可作为南非叶多酚提取分析及预测的依据.

2) 南非叶多酚最佳提取工艺为：液料比 30 mL/g，乙醇体积分数为65%，超声时间 31 min和超声温度为 59 ℃，南非叶多酚提取率为 20.33 mg/g，相比预测值(20.36 mg/g)，算得相对误差仅0.15%，表明该模型可靠性较高，试验得出的多酚提取工艺富有良好的实用价值，为南非叶多酚的提取及开发提供新的研究方向.