急性胰腺炎大鼠模型白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α的表达及联合检测的意义

吕 芳，王松岩，张丽英，尚少红，罗燕青

（北京市石景山医院，北京 100043）

急性胰腺炎主要的临床表现为腹痛、腹胀、麻痹性肠梗塞等，严重的情况下也会引起全身炎症反应综合征，且发病快，死亡率高，可达30%以上，但是发病的具体机制不明确［1］。要想做到急性胰腺炎的早诊断就要对急性胰腺炎严重程度进行正确的评估，从而抓住治疗时机，提出有效的治疗方法，对患者预防并发症具有重要意义，同时也可以提高患者预后的生存质量［2］。白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α作为炎性因子，在炎性反应中发挥着重要的作用。近年来，许多专家学者专注于研究急性胰腺炎的发病机制，希望从中找到治疗急性胰腺炎的新方法［3］。本文通过建立急性胰腺炎大鼠模型，研究白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α的表达及联合检测的意义。

1 资料与方法

1.1 材料研究动物：选取50 只健康大鼠，由我院动物研究中心提供，雌雄不限，鼠龄2.8～6.2 月，平均鼠龄（3.4±1.7）月，体重200～250g，平均（220±7.9）g。所有大鼠均养殖在干净的笼子里，室温在（22.0±2.1）℃，相对湿度35%～40%，每天12 个小时光照，喂饮大鼠纯净水。经过一周饲养时间后，随机分为正常组和模型组，各25 只。两组大鼠在年龄以及体重上均无统计学差异，具有可比性，所做实验均获得我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 模型建立模型组25 只大鼠手术前要禁食12h，正常饮水。使用10%的水合氯醛配置溶液，进行腹腔注射，剂量为0.5mL/100g，麻醉满意后，将大鼠仰卧固定后，需要进行手术的区域进行酒精消毒，取腹部正中切口，将皮肤和皮下筋膜切开，将腹腔暴露，找出胰腺组织和十二指肠，在接近肝门的胆总管使用血管夹夹闭，选择4 号针头将牛磺胆酸钠经过十二指肠穿入到胆胰管5mm 处，注射时防止注射流入肠管，用手指按压十二指肠的乳头部位，缓慢匀速注入，之后会观察到胰腺组织红肿。当注射完成时，拔出针头，将肠道恢复原来的位置，5min 后取出血管夹，腹腔关闭。建模成功大鼠总计20 只，所有建模成功的大鼠术后背部均皮下注射5mL 的生理盐水，剂量为2mL/100g，8h/次，自由饮食。

1.2.2 大鼠小肠粘膜厚度、绒毛高度和上皮损伤检测

手术后留取大鼠直径为0.5～1.0cm，长度为10cm，使用5%的甲醛溶液固定后，经过石蜡包埋，使用苏木素染色，在光镜下检测，检查大鼠小肠粘膜厚度、绒毛高度并分析上皮损伤指数，进行病理学观察。

1.2.3 标本采集用手术刀割取所研究大鼠脱毛部位中间组织，大小为1cm×1cm，保存在-50℃的冰箱中。使用前一天取出，在5℃的环境中冰浴3min 后，用离心机以2500r/min 的转速分离，取上清液，保存至-50℃的冰箱中。

1.2.4 ELISA 法检测IL-6、IL-32 表达采用酶联免疫吸附试验法，将待测的标本和酶标物严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤进行，将待测标本和固相载体放置在一起产生反应作用，将固相载体反应后产生的复合物经过洗涤与其他物质分离，最后加入酶反应底物，经过酶的催化作用形成有色物质，根据颜色的深浅进行定量分析标本中IL-6、IL-32 表达水平。

1.2.5 免疫透射比浊法检测TGF-β、TNF-α表达

将待测标本放入特定蛋白分析仪中抗原抗体结合，形成复合物，经过一定时间反应观察浊度。光线经过混合溶液时会被免疫复合物吸收。复合物量越多，吸收光线越多，利用比浊计测定光的密度值，分析TGF-β、TNF-α表达水平。

1.3 统计学处理采用SPSS 21.0 统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差描述，两组间比较采用配对t 检验，P 值＜0.05 为具有统计学意义的标准。采用SAS9.4 软件对单独检测和联合检测的特异度、敏感度和准确度进行计算分析。

2 结果

2.1 两组大鼠小肠粘膜厚度、绒毛高度和上皮损伤的比较如表1 所示，模型组大鼠小肠粘膜厚度显著低于正常组，绒毛厚度显著低于正常组，具有统计学意义（P＜0.05）；模型组上皮损伤指数显著高于正常组，具有统计学差异（P＜0.05）。

表1 两组大鼠小肠粘膜厚度、绒毛高度和上皮损伤的比较

2.2 两组大鼠IL-6、IL-32 表达比较如表2 所示，模型组大鼠IL-6 表达显著高于正常组，IL-32 表达显著高于正常组，具有统计学差异（P＜0.05）。

表2 两组大鼠IL-6、IL-32表达比较

2.3 两组大鼠TGF-β、TNF-α表达比较如表3 所示，模型组大鼠TGF-β表达显著高于正常组，TNF-α表达显著高于正常组，具有统计学差异（P＜0.05）。

2.4 IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α联合检测的意义

如表4 所示，IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α敏感度、特异度、准确度存在差异，TNF-α单独检测敏感度显著高于其他三项，TGF-β单独检测特异度显著高于其他三项，具有统计学差异（P＜0.05）；IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α四项联合检测敏感度、特异度、准确度显著高于单项检测，具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 两组大鼠TGF-β、TNF-α表达比较

表4 IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α联合检测的意义

3 讨论

急性胰腺炎在临床上是最常见的急腹症，主要的特点是病情高危，且并发症多，患者的预后较差。造成急性胰腺炎的主要原因有很多，其中病理和生理上的原因较为复杂，多种原因形成，具体的发病机制尚未明确［4］。但是通过炎症介质发病的学说，越来越引起重视。胰腺是腺泡损伤后，会释放出具有活性的胰酶以及激活的巨噬细胞，会促进中性粒细胞产生大量的具有炎性的物质，其物质会导致胰腺血管的通透性的增强以及微循环会出现障碍，最终导致胰腺炎症的发生严重时会导致胰腺坏死［5-6］。要想抓住急性胰腺炎最佳是治疗时机，应该做到急性胰腺炎的早期诊断和对胰腺炎严重程度进行正确的评估，才能根据这些制定最佳的治疗方案，同时对患者预防并发症的发生、器官出现衰竭方面，具有重要的意义，及对患者预后生活质量的改善提高等方面也起到一定的积极作用［7］。

肠道是主要的消化吸收的器官，也是作为急性应激反应的重要器官，也是多功能器官出现衰竭的初始器官。当肠道中的肠粘膜通透性提高时，细菌和内毒素等会通过肠粘膜进入到其他组织，造成肠源的感染，严重会导致败血症或者急性前脑缺血致多器官功能障碍综合征［8］。高通透的肠粘膜屏障，会使肠道细菌和内毒素发生易位，和急性胰腺炎的胰腺坏死引发的细菌感染有紧密的联系，也是急性胰腺炎高死亡率的原因［9］。本文研究结果显示，模型组大鼠小肠粘膜厚度显著低于正常组，绒毛厚度显著低于正常组，模型组上皮损伤指数显著高于正常组，具有统计学差异。急性胰腺炎患者主要的临床表现是肠道黏膜出现缺损、缺氧，造成了肠粘膜的上皮损伤，导致肠通透性的提高。所以说，治疗急性胰腺炎的重中之重是维护肠道黏膜的结构和功能，同时也是医学界的主要研究内容。

白介素-6 是一种多肽，由纤维母细胞、单核细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、上皮细胞、胶质细胞以及多种肿瘤细胞分泌产生，刺激免疫细胞的分化增殖并提高其功能［10］。白介素-32（IL-32）属于促炎细胞因子，可以在机体内诱导树突状细胞的分化增殖，并使树突状细胞分泌大量的TNF-α、IL-6 等炎症因子，从而增强Th1、Th17 的应答反应，最终导致炎症反应的加重，造成组织的损坏，在炎症级脸反应中有重要意义［11］。本文数据显示，模型组大鼠IL-6 表达显著高于正常组，IL-32 表达显著高于正常组，具有统计学差异。说明，IL-6、IL-32 与急性胰腺炎有密切的联系。在健康人体的胰腺组织中含有少量的IL-32，当人体发生严重的炎症反应或者胰腺发生病变时，胰腺导管中的IL-32 水平会显著上升。转化生长因子-β（TGF-β）对于小胶质细胞的发育和稳定具有促进作用，能够调节胶质细胞的表型，对于神经元具有延缓死亡的作用［12-13］。TNF-α是一种具有炎性的细胞因子，主要是由巨噬细胞产生，当体内的TNF-α水平过高时，会引起炎性反应，造成器官的损伤［14］。TNF-α因子作为一种炎性因子，是重症急性胰腺炎的始动因子，导致胰腺炎以及胰腺外组织器官损伤［15］。在重症急性胰腺炎中，TNF-α水平显著升高，与胰腺炎是损伤和炎症的程度有密切关系在早期进行胰腺炎评估过程中具有重要的参考价值。在本文中，模型组大鼠TGF-β表达显著高于正常组，TNF-α表达显著高于正常组，具有统计学差异。说明，急性胰腺炎的发病与TGF-β、TNF-α有关。IL-6、IL-32、TGF-β及TNF-α敏感度、特异度、准确度存在差异，四项联合检测敏感度、特异度、准确度显著高于单项检测，具有统计学意义。说明，四项联合检测可以有效提升诊断效能，同时IL-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α水平也反映了机体的炎性状态。

综上所述，综上所述，白介素-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α的高表达能够在急性胰腺炎的诊断中起到非常重要的辅助引导作用，且这四项指标联合检测的敏感度、特异度、准确度较高，能够提升诊断效能，对急性胰腺炎的治疗与预后提供重要的参考价值。