嗅粘膜间充质干细胞与嗅粘膜嗅鞘细胞在人鼻粘膜中分布的研究

黄佩琦，卓 毅，段 答，龙 浪，蒋欣宸，赵振宇

（中国人民解放军联勤保障部队第九二一医院，湖南师范大学第二附属医院，长沙 410000）

神经损伤后修复是临床研究中有待攻克的难题。随着干细胞研究的进展，细胞移植治疗已用于神经修复，并且成为当今研究的热点。常用于细胞移植的种子细胞有胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPS cells）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）等。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），是一种多能干细胞，因其来源广泛，具有自我更新能力及多向分化潜能，在组织损伤修复与再生中得到广泛应用。根据其来源可分为脐带间充质干细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）、骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪间充质干细胞（adipose-drived stem cells，ADSCs）以及嗅粘膜间充质干细胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OMMSCs）等。Lima［1］等人于2005 年首次进行了人自体嗅粘膜组织移植治疗脊髓损伤的临床实验，表明嗅粘膜移植治疗脊髓损伤是一种安全、可行、有效的方法。

嗅鞘细胞（OECs）是由Golgi 和 Blanes 在嗅球中发现［2］的一种特殊的神经胶质细胞，是嗅神经的支持细胞，起源于嗅板，具有神经再生功能、抑制胶质增生、促进髓鞘化等功能［3］。嗅鞘细胞除了分布在嗅球的前两层，在嗅粘膜中也有发现［4］。有研究表明，hOM-OECs移植用于治疗中枢神经系统损伤［5-6］、帕金森病、阿尔兹海默症后可缓解患者症状［7-8］。OECs 联合干细胞移植治疗神经损伤效果优于单纯的干细胞或OECs 移植［9］。

本研究旨在通过获取成人鼻嗅区与呼吸区的粘膜组织，检测hOM-MSCs 与hOM-OECs 在鼻粘膜中的具体分布位置，为后期hOM-MSCs 与hOM-OECs 的取材培养、移植治疗神经损伤提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 患者资料研究对象选自从2017 年4 月～2017年10 月6 例解放军第九二一医院神经外科收治的神经损伤的患者，其中男患者3 例，女患者3 例，平均年龄42.50±12.26 岁。患者的具体信息及取材部位见表1。其中病例1～3 应用鼻内镜于鼻粘膜嗅区取材，病例4～6于鼻粘膜呼吸区组取材。在获取组织前告知患者情况，进行沟通并取得患者及家属的同意，签署自愿同意书；排除鼻腔肿瘤、鼻息肉以及嗅粘膜损伤、萎缩性鼻炎等嗅粘膜疾病的患者；在术前三天做好鼻内清洁，适当剃除鼻毛，滴加氯霉素滴鼻液等。

表1 患者信息及取材部位表

1.2 实验试剂与仪器CD271 一抗（美国Abcam），CD166 一抗（美国Abcam），CD105 一抗（美国Abcam），SOX10 一抗（美国Abcam），S100β一抗（美国Abcam），DAPI（Wellbio）Alex flour 594 标记羊抗兔二抗 IgG，Proteintech；Alex flour 488 标记羊抗兔二抗IgG，Proteintech；正置荧光显微镜（Motic）等。

1.3 鼻粘膜组织取材将 2%盐酸利多卡因浸润的湿棉球塞入鼻腔内进行粘膜表面局部麻醉，麻醉时间约 15 分钟，麻醉 2 次，麻醉后应用鼻内窥镜夹取所需部位的鼻粘膜组织（图1），所夹取的鼻粘膜组织块大小约为 5mm×5mm×5mm；其中嗅区粘膜组，其中包括上鼻甲内侧面，中鼻甲内侧后 1/3，呼吸区粘膜组，包括中鼻甲前 1/3，中鼻甲前 1/3 对应的鼻中隔，取鼻粘膜组织块，大小约为5mm×5mm×5mm，10%中性缓冲福尔马林溶液固定。

图1 鼻内窥镜下鼻粘膜组织的获取

1.4 组织HE 染色取福尔马林固定的组织块，包埋切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，蒸馏水浸洗，苏木素染1min，流水冲洗，置返蓝液内复染返蓝，伊红液染色1～3min，流水冲洗，梯度乙醇脱水，封固后镜下观察。

1.5 免疫荧光染色石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，热修复抗原，PBS 冲洗，10%正常血清/5%BSA 封闭，滴加适当稀释的一抗（CD271+CD105、CD271+CD166、CD271+SOX10、CD271+S100β），4℃过夜，PBS 冲洗3次；加二抗，37℃孵育90 min，PBS 冲洗3 次；DAPI 工作液37℃染核10 min，PBS 冲洗3 次；缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.6 统计学方法采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，所有数据以mean±SD 表示，2个样本均数的比较采用t 检验。P 值取0.05。

2 结果

2.1 鼻粘膜的组织结构在HE 染色镜下观察，嗅区黏膜组织结构分为三层：上皮层、基底层、固有层。上皮层主要由嗅觉受体神经元细胞、支持细胞、基底细胞、微绒毛细胞四种细胞构成，细胞形状排列规则，细胞间质少，没有血管，细胞具有两极性；基底层为一层均质结构；固有层为薄层的结缔组织结构，内含有管泡状的Bowman 腺的腺细胞、内皮细胞、成纤维细胞、毛细血管、淋巴管等（图2A-B）。呼吸区组织结构分为三层：由上至下分别为黏膜上皮层、黏膜固有层和黏膜下层。其中黏膜上皮层由柱状纤毛细胞、柱状细胞、杯状细胞以及基底细胞组成；而黏膜固有层与黏膜下层的细胞以浆细胞、肥大细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、白细胞等与免疫机制相关的免疫细胞为主，有丰富的黏液腺、浆液腺等腺体（图2C-D）。本实验通过HE 染色确定了鼻粘膜的嗅区及呼吸区的部位。

2.2 嗅粘膜间充质干细胞在嗅区及呼吸区的分布在成人鼻嗅区的上鼻甲及中鼻甲内侧鼻粘膜取材，及呼吸区的中鼻甲前1/3 及中鼻甲前1/3 对应的鼻中隔区鼻粘膜取材，均有CD271+CD166 与CD271+CD105 标记的嗅粘膜间充质干细胞分布（图3）。通过高倍镜下计数，嗅粘膜间充质干细胞细胞在嗅区粘膜为54.67±11.66/视野，在呼吸区粘膜为36.67±7.34/视野，嗅区多于呼吸区，差异有统计学意义（P＜0.05）。而嗅粘膜间充质干细胞计数在嗅区的上鼻甲及中鼻甲内侧无统计学差异（P＞0.05），在呼吸区中鼻甲前1/3 及中鼻甲前1/3 对应的鼻中隔区也无统计学差异（P＞0.05）。

2.3 嗅鞘细胞在嗅区及呼吸区的分布在嗅区的上鼻甲及中鼻甲内侧后1/3 的鼻粘膜组织中，均可见CD271+S100β细胞与CD271+SOX10 标记的嗅粘膜嗅鞘细胞存在。通过高倍镜下计数，嗅鞘细胞在嗅区上鼻甲粘膜为44.67±7.59/视野，在嗅区中鼻甲内侧后1/3的鼻粘膜为12.33±2.87/视野，上鼻甲多于中鼻甲内侧后1/3，差异有统计学意义（P＜0.05）。而呼吸区的中鼻甲前1/3 鼻粘膜组织及中鼻甲前1/3 对应鼻中隔区鼻粘膜组织未见嗅鞘细胞染色（图4）。

图2

图3

图4

3 讨论

3.1 hOM-MSCs 和hOM-OECs 自体移植在神经修复的作用成人神经损伤后修复比较困难，自体干细胞移植是有效的治疗方法之一，其中间充质干细胞因具有多向分化潜能是理想的种子细胞。较常用的有脐带间充质干细胞，其促进修复方面的效果好，但脐带间充质干细胞获取来源相对有限。骨髓间充质干细胞需骨髓穿刺获得，向神经分化的潜能逐渐减弱，纯化难度较大，病毒感染率较高［11-11］；脂肪间充质干细胞的来源丰富，生长迅速，存活时间较骨髓间充质干细胞长，但其纯化问题有待进一步的解决。因此嗅粘膜间充质干细胞是现阶段神经修复研究的热点。

嗅粘膜间充质干细胞是2010 年Huard［12］等人首次在人嗅粘膜中发现存在的一类干细胞，来源于外胚层，不需要跨胚层分化成神经细胞，能够向神经元与非神经元细胞分化［13］；OM-MSCs 可以在体外定向诱导分化为表达多巴胺能神经蛋白抗体、络氨酸羟化酶等特异性标记物的多巴胺能神经元，将此细胞移植到帕金森病模型大鼠的纹状体，移植后大鼠的运动明显改善［14］；OMMSCs 移植到海马病变的模型小鼠中，移植后的海马区存在再生的神经元［15］；将鼠嗅粘膜固有层移植治疗大鼠完全脊髓损伤模型，移植后的模型大鼠，其脊髓损伤处的髓鞘再生，反射重新建立，躯体运动功能有所恢复［16］。自体hOM-MSCs 移植治疗脊髓损伤的相关研究结果表明，脊髓损伤患者在移植后多有较为满意的神经功能恢复，而且患者在移植后并未出现发热、抽搐、粘膜炎症感染、腹泻、恶心、呕吐、头晕、头痛、骨骼肌肉疼痛等不适［17］，移植后安全性高。而OM-MSCs 移植后能够改善神经功能，可能是因为OM-MSCs 能够产生多种神经营养因子，改变损伤部位的微环境从而达到神经修复的作用［18］。此外，OM-MSCs 在移植后因与宿主细胞有相互作用而产生多种可溶性的营养因子［19］。而同时移植OECs 能够促进MSCs 向神经元分化［20］、分泌蛋白SC1 能够促进神经元的突触形成［21］，OM-MSCs 则通过旁分泌因子也产生多种细胞营养因子［18］作用于OECs，加强OECs 的增殖能力和成髓鞘作用。

3.2 嗅粘膜作为自体细胞移植取材部位的优势hOMMSCs 与hOM-OEC 广泛存在于患者鼻粘膜组织中，可以通过鼻内镜为患者取材，在取材后一个月复查可见鼻粘膜完全愈合，且未对患者的嗅觉造成影响及损伤。嗅粘膜处取材来源进行间充质干细胞的培养，较骨髓穿刺及其他部位取材容易且安全。对患者造成的损伤小，患者易于接受，自体细胞培养移植不存在免疫排斥反应与伦理争议性。现在OM-MSCs 有成熟完善的培养体系，培养hOM-MSCs 增殖效率高，传代时间短；且生物学活性不受年龄的限制，不随年龄的增大而减小；安全性高，染色体核组分析与肿瘤基因分析，其体外培养无限传代后没有基因变异［22］。在嗅粘膜和嗅球的嗅神经纤维层与小球层中均有OECs 的分布，嗅粘膜和嗅球获取均可获取，但嗅球位于颅内，如要获取需经开颅手术风险较大。而嗅粘膜的获取无需开颅，仅需在局麻条件下经鼻内窥镜夹取嗅粘膜组织块。因此鼻粘膜处是理想的hOMMSCs 与hOM-OEC 的取材部位，但是hOM-MSCs 与hOM-OEC 在鼻粘膜中具体的分布部位的研究还不多。

3.3 hOM-MSCs 和hOM-OEC 在鼻粘膜的分布鼻腔粘膜范围起自鼻前庭的鳞状上皮和柱状上皮的过渡区，向鼻腔内延伸，分布于鼻腔的各壁及鼻道表面，可分为呼吸区和嗅区。其中呼吸区粘膜占鼻腔的绝大部分，范围包括鼻前庭、中鼻甲前端和下鼻甲以及所对应的鼻中隔区域，主要起调节、过滤以及清洁作用，纤毛运动产生传送作用，并不具有嗅觉功能。嗅区粘膜，又称为嗅膜，具有嗅觉功能。在成人，嗅区粘膜分布于上鼻甲的内侧面及中鼻甲内侧后1／3 的区域以及对应的鼻中隔。嗅板通过凹陷形成小孔，上覆结缔组织，称之为嗅窝，而嗅窝仅分布于嗅粘膜层，与Bowman 腺一样，这是区分于呼吸区粘膜的标志［23-24］。嗅粘膜固有层包含hOM-MSCs 及血管的内皮细胞、雪旺细胞、Bowman腺腺细胞等多种组织细胞。OECs 是包绕在从上皮层延伸至固有层并进入嗅球的嗅觉受体神经元（ORNs）外周［25-26］，分布在嗅粘膜进入嗅球的浅表两层结构中。

本实验通过对人鼻粘膜进行免疫荧光染色，标记组织切片中的hOM-MSCs 与hOM-OECs，结果证明，hOM-MSCs 在嗅区与呼吸区粘膜固有层均有分布，且嗅区细胞数与多于呼吸区粘膜。hOM-OECs 主要位于嗅区鼻粘膜，呼吸区粘膜几乎无细胞染色，嗅区上鼻甲细胞数多于中鼻甲内侧。

综上所述，人鼻粘膜的嗅区粘膜的上鼻甲部位广泛分布 hOM-MSCs 和hOM-OECs，建议神经修复需要干细胞培养自体细胞移植时，可在嗅区的上鼻甲处粘膜取材。