响应面法优化芽孢杆菌NBIN-863 的发酵工艺

刘晓艳，闵 勇，陈 伟，刘 芳，廖先清，周荣华，饶 犇

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

中国土壤正在不断恶化，土壤病虫害发生种类日趋复杂，特别是作物的线虫病害已成为常发性寄生虫害，但市场上可供选择的农药品种却很少，作物线虫病的防治难度日益增加。芽孢杆菌是一类广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物表体的生防菌，多数菌株无致病性、生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖、繁殖，对多种植物病害尤其是土传病害有较好的防控效果；同时生产芽孢杆菌制剂的产业化生产工艺简单，制剂稳定，储存期长，施用方便，对人畜安全，对环境友好，是一种理想的防控线虫的微生物菌剂［1-5］。

在前期的研究中分离得到苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）NBIN-863 菌株，研究表明其能显著抑制线虫生长，具有一定的开发价值。通过对该菌株进行发酵培养基的优化［6-8］，可以提升该菌株的发酵水平，加快其产业化进程。本研究对NBIN-863的培养基配方进行Plackett-Burman 试验，筛选显著的影响因子，通过中心组合设计和响应面分析，获得最优培养基组合，以期为该菌株的扩大生产及产业化提供支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

苏云金芽孢杆菌NBIN-863 由湖北省生物农药工程研究中心分离和保藏。

1.2 供试培养基

①种子培养基。LB 液体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，500 mL 三角瓶装液量为100 mL；②初始发酵培养基：淀粉10 g，豆粕20 g，磷酸二氢钾0.1 g，去离子水1 L，pH 7.5，500 mL 三角瓶装液量为50 mL。

1.3 摇瓶培养

斜面菌种活化后接入LB 液体培养基，30 ℃、摇床转速220 r/min 条件下培养16 h，按2%（V/V）接种量再接入到发酵培养基中至芽孢脱落分离20%。

1.4 芽孢数的测定

培养结束后发酵液芽孢数采用稀释涂布平板计数法测定。1.5 方法1.5.1 Plackett-Burman（PB）设计 采用Minitab 的Plackett-Burman 两水平法对培养基成分进行分析，筛选影响生物量和芽孢产量的主要因素，确定最佳配方。

1.5.2 最陡爬坡试验 根据PB 试验得出的拟合方程，安排最陡爬坡试验来确定因素，取值中心点。拟合方程中各变量系数确定爬坡方向和变化步长，此外，步长确定与试验条件相关。

1.5.3 中心组合设计和响应面分析 根据PB 试验得到的因素，以最陡爬坡试验得到中心点，根据中心组合设计原理设计响应面试验的最佳配方水平。得到描述响应值和自变量之间关系的二阶模型，即：

式中，Y 是产物能力测量值；b0是截距；bi是关键因素线性效果的系数；bii是关键因素二次效应的系数；bij是关键因素间交互作用的系数；e 是修正系数。

根据拟合的模型以及方差分析的结果，可以评价每个因子及其交互作用对过程的影响程度，利用响应面和等高线直观地描绘其结果，同时利用拟合方程求解最优的结果。

1.5.4 培养基优化结果的验证试验 用优化后的培养基组分配制发酵培养基，发酵结束后测定发酵液的芽孢数。

1.5.5 20 L 罐发酵 用优化后的培养基组分配制发酵培养基，投料体积10 L，消泡剂0.2%，灭菌前pH 7.5，1×105Pa 灭菌30 min。待温度降至32 ℃时接入1%（V/V）的种子液，通气比1∶0.5～1.2，罐压0.5×105Pa，培养温度30～32 ℃，搅拌常开，发酵过程中取样镜检，芽孢脱落分离20% 时结束发酵。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 试验设计

根据前期单因素试验研究结果，确定以淀粉为碳源，以豆粕、酵母膏、工业蛋白胨为氮源，共4 种因素：X1（淀粉）、X2（豆粕）、X3（酵母浸粉）、X4（工业蛋白胨）一起进行Plackett-Burman 设计试验，发酵结束时稀释20 倍测定死亡率，设计方案和试验结果见表1。

由表2 可知，淀粉和豆粕对NBIN-863 的效价有显著影响，且两者对芽孢形成的影响均是正效应。

表1 Plackett-Burman 试验设计与结果

表2 Plackett-Burman 试验各因素参数的t检验分析结果

得到的回归方程如下：

方程拟合的相关性为R2=0.905 7，表明此多项式方程很好地模拟和解释了Plackett-Burman 的试验结果。

2.2 最陡爬坡试验

找到对产物发酵影响最大的因素，对这些因素进行进一步分析。最常用的分析方法就是响应面分析，但响应面分析是一种局部的分析方法，是在一定范围内根据试验求得最优解。因此，在进行响应面分析试验前，首先应当通过试验找到最优值附近的区域，在此区域内再进行响应面试验。

利用最陡上升法试验，以前述Plackett-Burman设计试验得到的一次方程为基础，以相应因素的系数比为基准进行步移，直到步移至最高点，然后以最高点附近的范围作为响应面优化的相应范围。从Plackett-Burman 设计试验得到方程中淀粉和豆粕的系数（X1为9.000，X3为9.333），进而可以得这2个因素步移的步长比为0.96∶1，即当豆粕步移1 个单位（5 g/L）时，淀粉步移0.96 个单位（4.8 g/L）。以Plackett-Burman 设计中的中心点（淀粉为25 g/L；豆粕为25 g/L）作为步移的起点，试验设计与试验结果见表3。从表3 可以看出，开始时NBIN-863 对线虫的致死率随着淀粉与豆粕的升高而增加，在步移进行至第二步时达最高点，之后NBIN-863 发酵液的致死效果开始下降。步移最高点时淀粉与豆粕的浓度分别为34.6 g/L 和35 g/L，这一点被用作下一步响应面分析的中心点。

表3 最陡爬坡试验设计与结果

2.3 中心组合设计试验及响应面分析

由以上2 水平Plackett-Burman 试验可知，影响NBIN-863 致死率的2 个重要因素分别是淀粉与豆粕。根据中心优化组合方法，设计了2 因素5 水平的响应面分析（RSA），试验设计见表4，共13 组试验。

以淀粉和豆粕为自变量，以NBIN-863 对线虫的致死率为响应值，根据分析结果得到的二次多项式回归方程为：

式中，Y 为响应值，X1为淀粉，X2为豆粕。

利用Minitab 软件对回归模型进行响应面分析，考察所拟合响应面的形状，结果见图1 和图2。由图1、图2 及软件分析可知，该模型具有最大值，利用Minitab 软件响应优化器进行计算可得，最大值处X1= 35.2 g/L，X2=34.7 g/L，在此条件下理论预测得到线虫致死率为81.2%。

表4 中心优化组合设计与结果

图1 NBIN-863 发酵液对线虫致死率的等值线

图2 NBIN-863 发酵液对线虫致死率的曲面分析

2.5 最佳培养基的验证

为了确定试验结果的可靠性，对上述优化培养基进行了验证试验，共进行3 组平行试验，测得NBIN-863 发酵液对线虫的致死率为83.0%，与预测值（81.2%）十分接近，比优化前NBIN-863 的实际致死率（45.0%）提高了84%。

2.6 20 L 罐发酵

发酵周期36 h，放罐时取样镜检，约20% 芽孢脱落，伴孢晶体全部形成，晶体含量为5.4 mg/mL，芽孢整齐。发酵液经稀释后，其对线虫的致死率是81.0%，较好地保持了揺瓶发酵时的活性。

3 讨论

前期研究表明，影响NBIN-863 菌株活性的关键因素为淀粉与豆粕。通过优化获得NBIN-863 菌株最佳培养基配方为淀粉35.2 g/L、豆粕34.7 g/L、酵母浸粉4 g/L、工业蛋白胨3 g/L。在此条件下，测得NBIN-863 发酵液的晶体含量为5.4 mg/mL，稀释后对线虫的致死率为81.0%，比优化前NBIN-863的实际致死率提高了80%，为其工业化生产奠定了基础。