韦伯潘力氏小体及其内容物对血栓形成的影响

王芳磊，龚国清

(中国药科大学药理学研究室，江苏 南京 211198)

韦伯潘力氏小体(Weibel-Palade bodies,WPBs) 是一种内皮细胞特有的雪茄型分泌细胞器，主要存在于动脉、毛细血管、静脉和心内膜中。WPBs储存了血管性血友病因子(von Willebrand Factor,VWF)、P选择素、组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)、白介素-8、嗜伊红素-3、血管生成素-2、内皮素-1等多种内容物[1]。这些内容物通过胞吐作用分泌到内皮细胞外，参与止血、炎症和血管生成等多种生理病理过程。血栓是机体凝血-抗凝功能失衡时，血液中有形成分在血管内黏附聚集形成的血块，会造成血管部分或全部堵塞。血栓形成频繁发生在如动脉粥样硬化等心脑血管疾病患者和部分恶性肿瘤患者中，这一定程度上会加剧这些疾病的发生发展，严重威胁着人类的健康[2-3]。本文主要综述了WPBs及其主要内容物对血栓形成的影响。

1 WPBs及其对血栓形成的影响

内皮细胞是血管系统和组织的主要边界，负责调控代谢产物、其他小分子以及能够穿透内皮屏障的细胞的转运，涉及复杂的转运系统和内皮细胞与细胞间连接的动态调控。内皮细胞胞吐作用是抵抗血管损伤的首要保护线之一，WPBs作为内皮特异性分泌颗粒，能够响应各种激动剂，快速提供止血和炎症介质。WPBs特殊的可弯曲的雪茄形柔性结构增强了其在内皮细胞细胞质有限空间内的可操作性[1]，这有利于在内皮细胞受到刺激时做出快速反应释放其内容物。WPBs内容物的含量并不是一成不变的，对于不同的血管状况需要内皮细胞产生不同分泌反应，为此WPBs会选择性地包含或排除某些内容物，并随着局部微环境的需要动态控制这些内容物的量[4]。例如，模拟层流的条件可导致WPBs中血管生成素-2含量降低；而暴露于促炎细胞因子会造成白介素-8上调等[4]。

新生WPBs在高尔基体中由管状VWF结合到网格蛋白包被的新生囊泡中形成，新生成的WPBs包含多个与高尔基体的连接，并通过这些连接将非管状VWF簇从高尔基体运输至WPBs腔，这些非管状VWF簇在WPBs中逐渐聚集成为更大的长串聚集体以促进WPBs生长[1,5]。成熟的WPBs厚约0.1 μm，长度可达3 μm。在生物发生和成熟期间，WPBs募集了一组Rab GTP酶(Rab27A、Rab3B/D和Rab15)和Rab效应分子(MyRIP、Slp4-a和Munc13-4)，两者相互作用介导WPBs与细胞骨架和质膜的相互作用，是WPBs快速胞吐作用的基础[6]。其中Rab27A与MyRIP相互作用阻止WPBs的过早分泌；Rab3D抑制胞吐作用，并控制WPBs的形成和形状。除此之外，成熟WPBs与质膜的最终融合还需要N-乙基马来酰亚胺敏感因子(N-ethylmaleimide sensitive factor,NSF)和可溶性NSF附着蛋白受体(soluble NSF attachment protein receptor,SNARE)家族的蛋白介导。Munc13-4是Munc13蛋白家族的成员，存在于静息内皮细胞中的WPBs上，并且能在组胺刺激后在WPBs胞吐作用的位点处聚集。Munc13-4被认为在SNARE介导的胞吐融合事件中起束缚和引发因子的作用，是诱发WPB胞吐作用的正调节因子[7]。有研究发现了一种膜联蛋白A2(AnxA2)-S100A10蛋白复合物，它的S100A10亚基是Munc13-4的相互作用物[7]。

WPBs的快速分泌是对血管损伤或感染的快速反应的基础，最大限度地减少了失血和病原体的传播[5,8]。由此我们可设想通过人为干预上述蛋白分子调节WPBs的快速分泌来寻找预防或治疗血栓的新靶点。鉴于AnxA2-S100A10介导成熟WPB的胞吐作用以及因此释放超长VWF纤维中的重要作用，干扰AnxA2-S100A10复合物形成可以作为控制VWF分泌的高度特异性工具，具有激活/抑制内皮细胞血栓形成的潜能。AnxA2中的S100A10结合位点限于N末端10至12个残基，合成包含该序列的肽可竞争性结合S100A10以破坏复合物以抑制血栓形成[9]。但这些N-末端AnxA2肽不能穿透细胞膜，因此它们在活细胞系统甚至生物体中的适用性受到很大限制，于是开发了一些具有膜渗透性的小分子化学抑制剂如3-羟基-1H-吡咯(5 H)-2-酮类似物和1,2,4-三唑类似物作为AnxA2与S100A10结合的抑制剂[9]。这些化合物弥补了N-末端AnxA2肽不能穿透细胞膜的缺点，并且可以特异性干扰AnxA2-S100A10复合物介导的血栓形成前反应过程中内皮细胞WPBs的对接/融合，具有优良的抑制血栓形成的作用。

2 VWF及其对血栓形成的影响

VWF是一种多聚体黏附糖蛋白，其前体由信号肽和一段D1-D2-D′-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK的保守结构域构成，其中D1D2结构域代表前肽，D′至CK结构域代表成熟的VWF[1]。在内质网中VWF前体去除信号肽，CK结构域以“尾-尾”方式形成二聚体，随后被转运至高尔基体[10-11]。在高尔基体中前肽被弗林蛋白酶切割下来，以指导D′D3结构域以“头-头”方式形成多聚体和进一步聚缩成小管[1,10]。VWF的修饰主要包括弗林蛋白酶切割、糖基化、氧化和硫酸化，有研究表明FAM20c (family with sequence similarity 20,member C)磷酸化VWF A2结构域中的S1517和S1613位点，这种修饰增强了VWF与血小板的相互作用[12-13]。目前FAM20c的抑制剂的研究大多关注于癌症、骨骼缺陷和低磷血症，尚未有关于抗血栓的FAM20c抑制剂研究，开发针对血栓的FAM20c的抑制剂是具有一定前景的新思路。VWF主要通过三种途径分泌，分别为基础分泌，调节型分泌和组成型分泌。WPBs中高度多聚化的VWF通过基础分泌和调节型分泌两种途径，未进入WPBs的不经历高度多聚化的VWF则通过组成型分泌途径[14]。基础分泌持续发生，而调节型分泌是通过激动剂介导的内皮活化触发的急性途径，在分泌过程中，WPBs的pH值逐渐增加至血液的弱碱性，致使前导肽解离，小管展开将超长VWF释放到血流中参与止血和血栓形成。

VWF参与血管众多生理与病理反应，是止血和血栓形成的核心。内皮细胞损伤时，WPBs快速反应，分泌VWF至基底膜，基底膜上暴露的胶原通过与VWF A1结构域相互作用而结合VWF，然后血小板膜上糖蛋白GPIb/IX再通过与VWF-胶原结合成复合物促使血小板初步黏附并被激活，随后VWF与整合素结合使血小板稳固黏附形成血栓[11,15]。同时P选择素、血管生成素-2和骨保护素进入WPBs也需要VWF的介导，其中P选择素是通过与VWF的D′D3结构域相互作用从而被包含入WPBs，而骨保护素和血管生成素-2则是通过与VWF的A1结构域相互作用进入WPBs。VWF对于血栓发生与发展的重要性是毋庸置疑的，开发靶向VWF的抗血栓药物在未来具有广阔的发展前景。

获得性血栓性血小板减少性紫癜(acquired thrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP)是一种由血小板在超大VWF聚集体上聚集引起的微血管血栓性疾病，病因是缺乏血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13),导致形成过多超大的VWF多聚体，病理性地触发血小板聚集形成血栓。这种微血管血栓的形成会导致多器官缺血，并可能导致危及生命的并发症[16]。Cablivi(Caplacizumab)是首个特异性的aTTP治疗药物，也是首个上市的纳米抗体药物。通过靶向VWF A1结构域抑制其与血小板GPIb/IX结合，Caplacizumab减少了由VWF介导的血小板黏附和消耗，防止微血管血栓的形成[17]。在Caplacizumab之前，aTTP没有特异性疗法，仅能采用免疫抑制剂或血浆置换缓解，但仍具有10%～20%死亡率且易发生耐受，Caplacizumab很好地解决了这一问题。纳米抗体具有分子量小的优势，但同时也存在半衰期短的问题，为了解决这一问题，Caplacizumab通过一个3*丙氨酸的linker，连接2个抗VWF的纳米抗体以此延长半衰期。

3 P选择素及其对血栓形成的影响

P选择素是一种糖蛋白，在血小板和内皮细胞上表达，分别储存于血小板的α颗粒和内皮细胞的WPBs中。P选择素具有一个大内腔结构域和短胞质尾区，内腔结构域是P选择素并入WPBs的定位结构。在受到炎症因素等刺激时，WPBs分泌P选择素至细胞膜与中性粒细胞和单核细胞上的P选择素糖蛋白配体(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)相互作用进而介导中性粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面的滚动与血小板的黏附，进一步诱导血小板活化，扩大血栓的发生[18]。例如组胺，有研究提出组胺会唤起质膜上携带P选择素的WPBs发生胞吐作用，释放P选择素之后Rab46依赖性地诱导WPBs逆运输至微管组织中心[19]。同时有研究发现在激光损伤诱导的血栓形成模型中，给予P选择素阻断抗体的VWF-/-小鼠血栓生长速率显著降低。这些研究均表明了P选择素对促进内皮细胞上血栓的增殖重要性[20]。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptor -γ，PPARγ)是由配体激活的转录因子，具有调节脂质代谢、血压和胰岛素敏感性等作用，在血管内皮细胞中广泛表达。E-V290M小鼠是一种选择性表达显性失活PPARγ突变体的转基因小鼠模型。与野生型小鼠相比，E-V290M小鼠更易产生由氯化铁或光化学损伤诱导的颈动脉血栓，其 P选择素表达和白细胞-内皮细胞相互作用均显著上调。由此可推测PPARγ通过下调内皮细胞P选择素表达和减少P选择素介导的白细胞-内皮细胞相互作用抑制血栓形成[21]。有数据表明，噻唑烷二酮类药物作为PPARγ激动剂，可以通过加速血管内皮再生，抑制血小板活性和减少血栓前因子的表达来减少动脉损伤后的血栓形成趋势[22]。

炎症与血栓的密切关系使得P选择素这个在两种生理病理过程中都有着重要作用的蛋白受到高度重视，已经开发出抗P选择素抗体用于血栓和(或)炎症的治疗，如重组可溶性P选择素糖蛋白配体-1等。因此，抗P选择素治疗血栓将随着P选择素与血栓性疾病研究的深入和阐明，具有良好的临床应用价值和前景。

4 其他内容物及其对血栓形成的影响

tPA具有高效的纤维蛋白溶解活性，当血栓形成时，tPA激活纤溶酶活性，确保再通的及时性[23]。内皮素-1是人类心血管系统中最有效的血管收缩剂，具有非常持久的作用[24]，其血浆水平可能有助于预测一般人群中充血性心力衰竭和死亡风险[25]。WPBs分泌内皮素-1导致的血管内皮功能障碍促进了血栓的形成，高内皮素-1水平的患者在接受经皮冠状动脉介入治疗后发生支架内血栓形成的概率大大升高[25]。血管生成素-2是血管形成和维持的关键调节剂，可将血管炎症从活跃状态转化为静止状态，从而恢复组织的稳态[26]。研究发现血管生成素-2和P选择素相互排斥，前者仅掺入缺乏P选择素的WPBs中[1]。鉴于此种情况，我们不妨猜测通过干预包含血管生成素-2的WPBs的数量，以此减少含P选择素的WPBs数量可抑制血栓形成，这也许能够为广大研究者们提供抗血栓药物研究的新思路。

5 展望

随着对WPBs的生物发生及其快速分泌机制研究的深入，WPBs快速分泌VWF和P选择素等内容物对血栓形成的影响越来越清晰。目前研究发现，内皮细胞受激活化时，WPBs快速反应释放VWF和P选择素等因子，这些因子通过与胶原、血小板糖蛋白GPIb/IX、中性粒细胞和白细胞等相互作用参与或促进血栓形成。在WPBs众多内容物中，对血栓影响最大的是VWF和P选择素，两者都直接参与血栓的形成，内皮细胞P选择素在一定程度上受VWF调控。以WPBs以及VWF等因子为靶点的抗血栓抗体或化合物如卡普塞珠单抗和3-羟基-1H-吡咯(5 H)-2-酮类似物等都具有良好的抗血栓效果。鉴于WPBs、VWF和P选择素在血栓疾病中扮演着重要角色，深入研究WPBs快速分泌的调控机制，VWF和P选择素参与血栓形成的作用机理，有望为血栓相关疾病的防治提供更多有效的新靶点，也将在今后的抗血栓药物研发策略中带来新的思考方式。