鼻腔用冷敷凝胶的急性毒性及纤毛毒性实验研究

2020-04-01 10:33严国鸿林亚娟胡博志徐伟王晓颖
药学研究 2020年2期
关键词:纤毛冷敷生理盐水

严国鸿,林亚娟,胡博志,徐伟,王晓颖

(1.福建中医药大学附属人民医院,福建 福州 350122;2.福建中医药大学,福建 福州 350122;3.蓝佳堂生物医药<福建>有限公司,福建 福州 350007)

鼻黏膜容易受到外来有害物质或致敏性物质的侵扰,从而引发鼻充血、鼻炎,继而可能会造成耳部不适、干扰听觉、影响发音,甚至会影响睡眠。配合药物治疗,缓解局部症状的鼻腔用敷料成为临床需求之一[1-3]。蓝佳堂生物医药(福建)有限公司研发的由卡波姆、聚乙二醇、卵黄分离物、薄荷脑等组成的鼻腔用冷敷凝胶Ⅱ型(简称鼻腔凝胶),针对鼻黏膜局部症状使用,令使用部位的毛细血管收缩,减轻局部充血,黏膜神经末梢的敏感性降低,可以达到冷敷的目的;并有助于缓解急慢性鼻炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎及普通感冒等引起的不适症状(如:鼻塞、鼻痛、鼻干痒、流鼻涕、打喷嚏等),也可用于鼻窦术后或放疗后的冷敷护理,适合临床需求。

鼻腔制剂或敷料使用后,由于其组成成分的影响,鼻纤毛运动常会受到不同程度的损害,甚至可使纤毛运动不可逆的停止,影响鼻纤毛的清除功能,故对鼻纤毛毒性的影响是鼻腔制剂或敷料的重要研究内容之一[4-5]。本实验采用牛蛙上颚离体法,对鼻腔凝胶的鼻纤毛毒性进行了研究[6-7],并以高于临床给药浓度100倍的鼻腔凝胶浓缩液,测定该鼻腔凝胶的急性毒性,为鼻腔冷敷凝胶的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 ICR小鼠,清洁级,雌性,体重24~33 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,实验动物许可证号:SCXK(沪)2016-0002。

1.2 试剂 冷敷凝胶Ⅱ型(鼻腔)[蓝佳堂生物医药(福建)有限公司,批号:L01332101];脱氧胆酸钠(美仑生物有限公司,批号:S0802A)。

1.3 仪器 Nikon YS100型生物显微镜(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 急性毒性评价

2.1.1 急性毒性试验预试验 取20只ICR小鼠,雌雄各半。给药前禁食不禁水 12 h 后进行称重。体重相近的4只为一组,共5组。再随机从各组中取2只作为给药组,剩余10只作为生理盐水对照组。按小鼠灌胃最大给药剂量为0.3 mL/10 g,最多不超过1.0 mL/只,灌胃鼻腔凝胶,其浓度为临床制剂浓度的100倍。给药后记录小鼠体重、外观、行为、饮食、分泌物、排泄物的变化。

2.1.2 小鼠一日最大耐受量(MTD)的测定 因鼻腔凝胶用最大允许浓度和最大允许容量给予动物时仍未能测出LD50,为进一步研究该鼻腔凝胶的毒性情况,做一日最大耐受量(MTD)测定。取 ICR小鼠20只,按0.3 mL/10 g剂量进行灌胃给药,间隔6 h给药1次。给药3次后连续观察7 d,记录小鼠给药后外观(体重、皮肤毛发、眼和黏膜的变化)、行为、饮食、分泌物、排泄物及其中毒和死亡情况,生理盐水组按上述同法操作。

2.2 鼻纤毛毒性

2.2.1 鼻纤毛毒性考察方法[6-7]为考察鼻腔凝胶对纤毛运动的影响,选择牛蛙上颚黏膜作为动物模型。将牛蛙脊髓捣毁后,仰卧固定于自制蛙板上,使口腔张开,用止血钳牵拉,用胶头滴管往上颚黏膜滴加3滴鼻腔凝胶,使黏膜完全被药物淹没。接触10 min后用手术剪小心分离上颚黏膜,分割成3 mm×3 mm的黏膜。用生理盐水洗去血块及杂物,纤毛面向上平铺于载玻片上,盖上盖玻片,置于40×10倍的光学显微镜下观察纤毛摆动及脱落情况。观察后立即将载玻片搁置于含有饱和蒸馏水的层析缸中,密闭 (环境温度20~25 ℃,水蒸气近饱和状态)。黏膜表面间隔30 min给药0.2 mL,每隔20 min从展开缸取出观察,直至纤毛停止运动。将从给鼻腔凝胶开始到纤毛停止摆动的时间(PVD)记录下来。纤毛停止摆动后,用生理盐水冲洗黏膜上的鼻腔凝胶,继续观察纤毛摆动可否恢复,并记录下纤毛恢复运动持续时间。另取阳性对照组(1%去氧胆酸钠)、空白对照组(生理盐水)处理方法同上,观察其纤毛摆动情况。

2.2.2 纤毛毒性评价方法[8]纤毛持续运动时间的百分率(PPV)=鼻腔凝胶组(或阳性对照组)的纤毛持续运动时间/生理盐水对照组的纤毛持续运动时间。PPV 越高,表示鼻腔凝胶组(或阳性对照组)对纤毛运动影响越小,即对纤毛毒性越小。

3 结果

3.1 急毒性试验评价

3.1.1 急性毒性试验预试验结果 小鼠给予鼻腔凝胶或生理盐水后,均出现短暂静卧,大约 1 h 后恢复正常,均无小鼠死亡情况。鼻腔凝胶组与生理盐水组小鼠,大、小便颜色正常,毛色光泽。连续观察7 d,分别于给予鼻腔凝胶或生理盐水后每天同一时间称量各组小鼠的体重。结果(见表 1)数据表明各剂量组小鼠体重与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)。给药后 14 d 各组小鼠无死亡、无异常反应。处死小鼠,解剖后,检测各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、胰腺、大肠、小肠等主要脏器体积、颜色、质地均无明显改变,故无法测得 LD50。

3.1.2 小鼠MTD测定结果 给予鼻腔凝胶或生理盐水后动物表现均无异常,除第 1 天小鼠灌胃后出现短暂不适,活动减少以外,均未见小鼠中毒与死亡。结果(见表2)表明鼻腔凝胶组小鼠体重与生理盐水组比较无统计学差异(P> 0.05)。给予鼻腔凝胶或生理盐水后7 d 各组小鼠均无死亡及任何异常反应。处死小鼠后观察其心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、胰腺、大肠及小肠等主要脏器体积、颜色、质地均无明显改变。本实验给予小鼠的鼻腔凝胶浓度为成品浓度的100倍,日累积剂量为临床成人拟推荐日用剂量的160倍。表明鼻腔凝胶型临床应用的安全性较高。

表1 一日最大给药量各组小鼠体重变化(n=20)

表2 一日最大耐受量各组小鼠体重变化(n=20)

3.2 鼻纤毛毒性试验结果 显微镜下观察结果显示,生理盐水组和鼻腔凝胶组纤毛清晰完整(如图1A),排列整齐,有规律地向同一方向摆动,纤毛运动活跃,呈“风吹麦浪”式摆动[8],且摆动频率极快;鼻腔凝胶组纤毛较清晰,纤毛运动较活跃(见图1B)。给予脱氧胆酸钠后,纤毛停止摆动、纤毛边缘基本脱离,黏膜受损较严重,部分基部裸露(见图1C),表明脱氧胆酸钠对黏膜组织有严重的破坏作用,对纤毛运动有严重的不可逆的抑制作用。

本实验采用多次给药牛蛙上颚黏膜,每隔30 min对牛蛙上颚黏膜滴加2 mL鼻腔凝胶,纤毛持续运动时间为(187.6±66.4)min,相对运动百分率为69.4%,结果见表3。当纤毛停止运动后,用生理盐水冲洗黏膜上的鼻腔凝胶,纤毛恢复摆动记录其恢复摆动时间为(23.6±6)min。说明该鼻腔凝胶对鼻纤毛的毒性较小,纤毛毒性可逆,可以应用于鼻腔局部。

表3 各组纤毛持续运动时间和持续运动百分率

4 讨论

通过急性毒性实验证明该鼻腔凝胶安全性良好,并且牛蛙黏膜纤毛实验显示单次使用后其对纤毛运动无影响。本实验考虑鼻腔凝胶连续使用的问题,采用多次给药方式,测得纤毛持续运动时间的百分率为69%,纤毛停止运动后,用生理盐水冲洗后纤毛可以恢复摆动,说明对黏膜纤毛的损伤并不严重,但仍要注意合理的给药间隔和给药次数。

鼻腔凝胶为鼻腔用敷料,主要用于缓解鼻腔黏膜由于炎症及感冒等引起的充血等不适,配合临床药物治疗使用,减少患者的痛苦[9-10]。经测试,鼻腔凝胶安全性良好,对鼻纤毛的毒性小,对纤毛的影响具有可逆性,可以用于鼻腔局部,在临床应用上有较好的应用前景。

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