参与辣椒素合成的DnaJ基因家族全表达谱分析

Fang Fanfei Liu Fawan Yang Xian Wan Hongjian Kang Yunyan *

（1. 华南农业大学园艺学院， 广州 510642； 2. 云南省农业科学院园艺研究所， 昆明650231； 3. 浙江省农业科学院蔬菜研究所农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室， 杭州 310021； 4. 浙江省农业科学院中澳农作物改良研究中心， 杭州 310021）

前言

DnaJ蛋白是最初在大肠杆菌中被鉴定为41-kDa的热休克蛋白[1]。一般由J域、G/ F域、锌指（CxxCxGxG）域和C-terminal序列4个域组成[2-5]。之前的研究试图根据其结构特点将DnaJ蛋白分成三类（I/II/III）[6]。第一类由J域、G/F域和锌指域组成，第二类由J域和G/F域或锌指域组成，第三类只有J域[7]。

植物生长发育是一个受多种机制网络调控的复杂生物过程。许多DnaJ蛋白被报道参与这一工程，并在其中发挥了重要作用。众所周知，光合作用发生在叶绿体中，是植物生长发育的重要生理过程[8]。前人研究已经揭示了DnaJ蛋白对叶绿体发育的重要意义。例如，位于拟南芥叶绿体膜上的DnaJ蛋白ARC6，通过装配或稳定FtsZ环，成为叶绿体分化的关键因子[9]。随后，Chen等[10]发现AtJ8、AtJ11和AtJ20 3个小叶绿体靶向DnaJ蛋白质中既有特异功能，也有交叉功能。这些小蛋白参与多种生理生化过程，包括CO2固定的优化、PSII复合物的稳定和电子转移反应的平衡[10]。近年来，拟南芥DnaJ-like锌指蛋白成员已经被报道参与质体的发生和稳定。蛋白家族成员之一PSA2被发现定位于类囊体腔，调节光系统I的积累。结果表明，PSA2影响叶绿体的发育[11]。此外，大量关于DnaJ蛋白在水稻中的功能作用研究与之前报道是一致的。Zhu等[12]清楚地阐明了OsDjA7/8是水稻叶绿体发育所必需的蛋白质，它可能直接或间接地与其他蛋白质发生作用。

植物DnaJ蛋白的功能不仅与植物的生长发育有关，而且与植物对非生物胁迫的抗性有关。定位于线粒体的BIL2基因属于DnaJ家族成员[13]。BIL2基因通过表达的拟南芥植株对盐胁迫和强光胁迫表现出了抗性[14]。从番茄（Solanum lycopersicum）中分离到一种以叶绿体为靶点的DnaJ蛋白（LeCDJ1），在低温胁迫下上调表达。此外，研究人员进一步发现过表达LeCDJ1提高了PSII对低温胁迫的耐受性，抑制LeCDJ1增强了PSII对低温的敏感性。结果表明，在低温胁迫下，LeCDJ1对 维 持PSII起 重 要 作 用[15]。2015年，在转基因番茄中发现了第二个番茄叶绿体靶向DnaJ蛋白SlCDJ2。研究人员报道，在热胁迫条件下，SlCDJ2的过表达表现出较高的Rubisco活性、Rubisco大亚基含量和CO2同化能力，但反义植物与野生型植物相比表现出较低的水平。结果表明，番茄过表达SlCDJ2通过减轻热应激诱导的Rubisco损伤，提高了番茄的耐热性；抑制SlCDJ2则增强了Rubisco损伤，降低了热诱导的损伤。

辣椒（Capsicum annumL.）是一种重要的蔬菜作物，在世界各地广泛种植[16]。作为辣椒最重要的成分之一，辣椒果实的辛辣味是由一种被称为辣椒素的化学类似物引起的[17]。尽管辣椒素的生物合成途径（苯丙醇途径和支链脂肪酸途径）已被报道[18]，但调节这些途径的因素尚不清楚。

近年来，全植物基因组的测序为鉴定不同的基因家族提供了机会[19-22]。在之前的研究中，我们对辣椒基因组采用生物信息学方法共鉴定了76个假定的辣椒DnaJ基因（CaDnaJ01toCaDnaJ01）[23]。通过对CaDnaJ基因家族进行全基因组分析，以揭示基因结构、保守基序、染色体定位、顺式元件以及在不同组织（根、茎、叶、果皮）和热胁迫条件下的表达谱。在大多数CaDnaJ基因的启动子区域发现了大量与应力相关的顺式元件，提示CaDnaJ可能参与了复杂应激条件下的响应过程[23]。

本研究选取了两个辣椒选育系（007EApungent和P2-nonpungent），分析了辣椒素生物合成和CaDnaJ基因相关因子的共表达模式。此外，我们还使用qRT-PCR检测了这些CaDnaJ基因对多种胁迫的响应。这些结果将有助于今后辣椒DnaJs的功能研究。

1 结果

1.1 辣椒CaDnaJ基因的系统发育分析

根据76条DnaJ蛋白序列的同源性，将辣椒DnaJ基因家族划分为7个亚家族（I、II、III、IV、V、VI和VII亚族）。如图1所示，以第VII亚族CaDnaJ基因（20个）数量最多，其次是第I亚族（17个），第III亚族（17个），第V亚族（9个），第IV亚族（8个）和第VI亚族（3个），而第II亚族基因最少，仅有两个CaDnaJ基因（图2）。

1.2 辣椒CaDnaJ基因的表达谱

基于RNA -Seq和qRT-PCR技术的植物组织/器官特异性表达分析可以为基因在不同组织/器官中的功能分化提供重要线索[24-27]。为了详细比较CaDnaJ在CM334中的表达，我们选择了CaDnaJ基因的RNA-seq数据进行进一步分析。包括CM334辣椒根、茎、叶、果皮和胎座（6 DPA、16 DPA、25 DPA、MG、B、B5、B10）的不同组织被用来进行基因表达分析。

表1 辣椒不同组织中表达的CaDnaJ基因亚族的组成

我们发现76个CaDnaJ基因中有29个在至少一个组织中表达（[RPKM]≥5.0被认为表达）（附表2）。对各亚科组成的分析显示，CaDnaJ亚科在被测组织中的表达存在差异（表1）。第III亚族成员在被测组织中拥有超过34%的CaDnaJ表达（图3），尽管只拥有22%的CaDnaJs（图2），但也表明其表达水平较高，可能在辣椒发育过程中起关键作用。相比之下，26%的检测到的CaDnaJs属于第VII亚族（图2），而检测组织中表达的VII亚族基因在所有分析组织中仅占10%（图3）。有趣的是，在第II亚族成员中发现了一种特殊情况，有两个基因在被测组织中没有表达（图3，附表S2）。

表2 辣椒不同组织中表达、优先表达和特异表达CaDnaJ基因的数量

1.3 CaDnaJ基因在不同组织中的表达模式

不 同 组 织 中29个RPKM值 大 于5.0的CaDnaJ基因被选择来进行进一步分析（附表S2）。如图4所示，少数CaDnaJs在被测组织中特异性表达，大部分CaDnaJs在两个或两个以上组织中表达。数据分析显示，营养组织(叶、根、茎)中特异性表达的CaDnaJs数量高于生殖组织(果皮、胎座)（表2）。此外,与其他组织相比，更多的CaDnaJ基因在果皮中优先表达。叶片和胎座具有相同数量的优先表达基因（表2）。

1.4 CaDnaJ基因在胎座中的表达模式

选 取CM334植 株 花 后6 d（6 DPA），16 DPA、25 DPA、青熟（MG）、转色（B）、转色后5 d（B5）和B10阶段的果肉和胎座，同时在非辛辣辣椒ECW30R植株中，选取6 DPA、13 DPA、20 DPA，MG、B、B5和B10共7个阶段的胎座，共同用于转录组测序分析[16]。为了揭示DnaJ的表达是否参与了辣椒素的合成，我们利用CM334和ECW30R研究CaDnaJ基因在胎座中的表达模式。转录组测序结果表明29个CaDnaJ基因中有8个基因（第III亚族的CaDnaJ25、47和56，第IV亚族的CaDnaJ10、40和74，第V亚族的CaDnaJ70和第VII亚族的CaDnaJ46）在CM334和ECW中表现出不同的表达谱（附表S1）。

对于CM334植株来说，CaDnaJ10、25和40在MG前期表达逐渐增加，然后保持高表达，而CaDnaJ47和70在胎座发育期间保持稳定。特别是CaDnaJ46在B期之前几乎没有表达，而在B期后期急剧增加。CaDnaJ56的表达在早期显著下调并保持稳定（附表S1）。

在ECW植株中，CaDnaJ25、47、74基因在胎座发育早期表达逐渐升高，之后一直保持低表达。CaDnaJ40、46、74在ECW中的表达随着胎座的发育而逐渐增加。相反，CaDnaJ70的表达随着胎座的发育而下调，在B10中很少表达。此外，CaDnaJ10和56的表达在全胎座发育阶段几乎保持稳定（附表S1）。

CM334中CaDnaJ47、56和70在 胎 座 整 个发育过程中表达高于ECW，而CaDnaJ10和25仅在MG期后表达高于ECW。相反，在整个胎座发育过程中，CaDnaJ40和46在CM334中的表达低于ECW中的表达。

为了进一步验证8个CaDnaJ基因在非辛辣和辛辣材料中的表达情况，采用qRT-PCR技术检测了P2（非辛辣）和007EA（辛辣）两个辣椒材料在胎座不同发育阶段的表达情况。如图5所示，所有8个CaDnaJ基因均表现出不同的表达谱。在P2和007EA中，8个CaDnaJ基因中有6个基因（CaDnaJ10、25、56、70、47和74）与CM334和ECW中RNA-Seq数据一致。进一步分析发现，CaDnaJ10、25、40和47在不同胎座发育阶段表达 上 调。CaDnaJ56、CaDnaJ70、CaDnaJ74在B期表达水平下调，其余6个时期表达水平上调。而在P2和007EA中，CaDnaJ40的 表 达 与CM334和ECW相反。

1.5 与CaDnaJ基因共表达的基因在胎座发育过程中参与辣椒素合成

CaDnaJs在胎座发育阶段的具体规律促使我们研究CaDnaJs是否与辣椒素合成相关基因共同表达。在此之前，已经鉴定出9个辣椒素生物合成基因（CBGs）[16]。本研究基于RNA序列分析，对这9个基因在胎座发育过程中的表达模式进行了分析（附图S2）。结果表明与辣椒素合成相关的所有基因在未成熟青果中的表达水平（5DPA、15DPA和25DPA）高于成熟红果（B、B+5和红熟果）。在这9个基因中，有3个基因（Pal1、BCAT和C4H）在007EA（辛辣）中表达低于P2（非辛辣），这与胎座发育阶段辣椒素的积累无关。对于KAS和FatA基因，我们发现这两个基因在P2中15DPA的表达水平高于007EA；但在25DPA时果肉中含量较低。这两个基因（KAS和FatA）与CaDnaJs在未成熟（25 DPA）果实中可能共同表达（附图S1）。其余4个基因（ACL、COMT、AMT和CS）在007EA的表达高于P2，这与CaDnaJs的表达一致（附图S1）。总的来说，通过对辣椒基因组组织特异性表达谱的检测，这9个基因中有6个基因似乎在胎座发育过程中与CaDnaJs共表达。

1.6 CaDnaJ基因在不同胁迫条件下的表达模式

非生物胁迫，如盐、热和聚乙二醇（PEG）对植物的生长和生理过程产生不利影响。本研究进一步研究了8个与辛辣化合物生物合成相关的CaDnaJ基因在各种非生物胁迫下的表达模式，探讨其在胁迫耐受中的潜在作用。在qPCR的帮助下，我们分析了8种CaDnaJs在高温、PEG和盐胁迫条件下的响应。结果表明，这8个基因分别受热、PEG和盐的调控（图6）。CaDnaJ74的表达在高温胁迫下显著上调，提示CaDnaJ74可能参与了植物对高温胁迫的响应过程。在干旱胁迫下，8个CaDnaJ基因的表达出现明显变化。结果显示，8个CaDnaJs中有5个基因（CaDnaJ10、25、46、47和56）表达显著上调。相比之下，CaDnaJ70则下调。研究结果表明CaDnaJs可能参与干旱胁迫反应。与干旱胁迫下的表达水平相比，只有在盐胁迫下，CaDnaJ70和74表达下调。

1.7 激素作用下CaDnaJ基因的表达模式

植物激素调节植物生长发育的多个方面，调节环境反应，以确保一个成功的生命周期[27,40-47]。在本研究中，为了研究CaDnaJ基因在激素处理中的作用，对6～8片真叶的辣椒幼苗进行了脱落酸（ABA）、GA3、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理（图7）。外源ABA处理中，CaDnaJ10、25、40和46共4个基因显著上调（图7）。对于GA3处理，除了CaDnaJ56和70两个基因，CaDnaJ10、25、40、46、47和74也 是 上调表达。MeJA和SA处理均诱导7个基因表达上调（CaDnaJ10、25、40、46、47、56和74）。相 反，CaDnaJ70在所有测试激素处理中均下调表达（图7）。以上的结果表明，这8个CaDnaJ基因是受到这些激素处理诱导的。

2 讨论

由于果实中含有丰富的辣椒素、营养物质和色素，辣椒已成为世界上仅次于番茄的第二大受欢迎的蔬菜[48-49]。最近, 广泛参与各种植物生长发育过程的DnaJ蛋白已在辣椒中得到鉴定[23]。本研究对辣椒全部76个DnaJ基因的表达谱进行了详细分析，结果显示38%（29）的CaDnaJs在至少一个组织中表达（附表S2），暗示CaDnaJs在辣椒植株生长发育中的潜在关键作用。对这29个CaDnaJs进一步分析发现，分别有5个、6个和3个CaDnaJs在叶片、根和茎中均有高表达，提示其在辣椒营养生长期中起着基础性作用（附表S2，表2）。通过研究还发现在辣椒果肉和胎座中分别有10个和5个高表达的CaDnaJs基因，说明这些基因在辣椒生殖生长期中具有保护作用（附表S2，表2）。此外，部分CaDnaJ基因的表达具有组织特异性。例如，CaDnaJ27和66在叶片中特异性表达。CaDnaJ 07、10、13、44、45、46和74共7个基因在根中特异性表达。而CaDnaJ 04在果皮中特异性表达。这些结果表明，这些基因可能与调控这些特定组织的生长发育有关。

辣椒的辛辣特性是由一组叫做辣椒素的化合物引起的，这是一种只在辣椒果实中积累的独特的生物碱。这些化合物在食品、化妆品和制药工业中越来越重要。辣椒素通常存在于辣椒内部的白色部分，被称为胎座。目前，辣椒素的生物合成途径包括关键CBGs和相关转录因子（TFs），如Erf、Jerf和CaMYB31已被大量阐明[50-51]。在这项研究中，为了分析DnaJ基因表达谱与辣椒素合成之间的关系，我们在辛辣（007EA）和非辛辣（P2）辣椒中分别选择（Pal1、BCAT、C4H、KAS、ACL、COMT、FatA、AMT和CS）9个参与辣椒素合成的基因进行研究[16]。其中，我们发现在IG（5 DPA、15 DPA和25 DPA）阶段，6个基因（KAS、FatA、ACL、COMT、AMT和CS）在P2中的表达比007EA中的表达要高。与胎座发育过程中8个CaDnaJs表达一致。发现CaDnaJs与辣椒素合成相关基因的共表达模式，提示这些CaDnaJs基因可能参与了辣椒素合成的调控。

通常，要了解每个基因的功能是如何发挥以及在哪里发挥的，需要对基因的时空表达模式[43,52-53]以及对各种非生物胁迫的反应[54-57]有详细的了解。辣椒果实中辣椒素的生物合成和积累受各种内因和环境因素的影响[58]，包括吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和赤霉酸（GA）等植物激素，以及温度、光照、伤害和干旱等应激条件。此外，环境对果实产量和辣椒素生产的影响可能因辣椒基因型而异。以往对7个辣椒杂交种和2个商品品种的研究证实，辣椒素产量的变异很大一部分（67.7%）是由环境条件引起的，而由基因型引起的变异只有42.4%[50-59]。相反，Tripodi等[60]报道在两个不同地区栽培的14个辣椒品种中辣椒素在环境中所占比例不到0.5%。

在我们的研究中，8个与CM334（辛辣）和ECW（非辛辣）胎座中的CBGs表达模式相似的CaDnaJ基 因（CaDnaJ10、25、40、46、47、56、70和74）被选择来研究它们对各种非生物胁迫和激素的反应中的潜在作用。这8种基因在高温、干旱和盐胁迫下的表达水平采用qRT-PCR方法测定（图6）。一些研究人员认为，在有限的供水条件下，中、低辛辣品种的辣椒素产量可以得到提高[61]。但同时，干旱条件下辣椒素含量下降或无变化的研究也已有报道[59-62]。我们的数据显示，干旱对这8个基因表达的影响比其他两种非生物胁迫更大。在干旱胁迫下，8个CaDnaJs中有6个基因的表达显著增加。只有两个基因CaDnaJ40和CaDnaJ70的表达水平略有下降。这一结果支持了先前的研究，即辣椒素的合成对水分胁迫敏感。

在以往的研究中，有报道SA、IAA和GA3处理促进了辣椒素3个结构基因CaMYB31、Kas和pAmt的表达，而JA处理后，除处理3 h时外，这些基因表达显著下降[50]。在我们的研究中，qRT-PCR分析显示，这8个CaDanJ基因在包括ABA、GA3、MeJA和SA的 4种不同激素处理后表达上调或下调（图7）。然而，与ABA、GA3和SA处理相比，我们没有观察到MeJA对这8个CaDanJ基因表达的拮抗作用。这一现象支持了辣椒的辛辣水平受到不同的植物激素或正或负调控的事实，植物激素的浓度和处理时间对辛辣程度有很大影响。

3 结论

在我们的研究中，我们在全基因组水平上对76个CaDnaJs进行了全基因组鉴定和表达分析。通过这些CaDnaJ基因和CBGs的共表达模式，证实了8个DnaJ基因参与了辣椒素合成的调控。此外，这8个基因被不同的非生物胁迫（热、干旱和盐胁迫）和植物激素（ABA、GA3、MeJA和SA）诱导，揭示了环境因素对与辛辣相关化合物生物合成的影响。这些结果为进一步分析辣椒的功能提供了新的信息。

4 方法

4.1 数据来源

辣椒的基因组序列从辣椒基因组数据库（PGD, http://peppergenome.snu.ac.kr/）[16]中获得。

4.2 系统进化分析

利用ClustalX程序 对辣 椒CM334中76个CaDnaJ成员的全氨基酸序列进行了排序。通过MEGA5.10软件建立系统发育树[63]，用相邻连接法、成对删除法和泊松模型进行系统发育bootstrap（1000次重复）检验。通过对其他4个物种DnaJ基因的多重序列比对和分类将辣椒CaDnaJ基因分配到不同的组。

4.3 辣椒DnaJ在不同组织中的表达分析

利用前人[16]所揭示的RNA-Seq数据，研究了CaDnaJ基因在6周龄CM334植株根、茎、叶中的表达模式。

CaDnaJ基因的RPKM （Reads Per Kilo bases per Million mapped Reads）值进行Log2转换[64]。根据Cheng等[65]的分类标准，根据表达水平和表达模式将基因定义为表达、特异性表达和优先表达。

4.4 植物生长和胁迫处理

两个自交系P2（非辛辣）和007EA（辛辣）材料由我们实验室提供，于浙江省农业科学院温室培育。从P2和007EA植物中获取包括未成熟青果（5DPA、15DPA、25DPA）、成熟青果、转色果、转色期+ 5天果、成熟红果的胎座，研究CaDnaJ基因在不同发育阶段的表达模式。

用于激素处理的007EA辣椒种子用10%次氯酸溶液灭菌5 min。将萌发的种子播种在育苗钵中（基质为泥炭∶珍珠岩体积比3∶1），置于26℃/19℃生长箱中生长至6～8片真叶，光周期为16 h/8 h。随后，向幼苗喷100 μM的茉莉酸甲酯（MeJA），100 μM的赤霉素（GA3）， 100 μM的脱落酸（ABA）以及1 000 μM的水杨酸（SA）溶液，4 h后取各处理叶片进行分析。

用200 mL 50 mM NaCl溶液对007EA辣椒幼苗进行灌根，进行盐胁迫处理。用200 mL 18% PEG灌根进行干旱胁迫处理。热胁迫处理采用42℃光照培养箱处理，25℃生长的植株作为对照组。4 h后取各处理叶片进行分析。

从浙江省农业科学院（杭州，浙江）温室栽培的007EA辣椒采集的激素处理（MeJA、GA3、ABA和SA）和非生物胁迫处理（42℃和Nacl）样本每个进行3次生物学重复，每个重复5株。从每株辣椒上收集5片叶子，并将它们混合在一起作为一个生物学重复。收集样品后立即用液氮冷冻，提取总RNA。

4.5 总RNA提取、逆转录及qRT-PCR分析

使用Total RNA和FastQuant RT的试剂盒方法进行总RNA提取和逆转录（试剂盒来自天根生物科技，中国北京）。采用ABI StepOne Plus Realtime PCR系统进行定量RT-PCR分析。按照SYBR qPCR试剂盒中的说明进行操作（维赞生物，中国南京）。循环条件为：94 ℃5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 30 s，33个循环，UBI基因作为内参[66]。用于扩增的基因特异性引物列于附表S1。用2-Δct法计算CaDnaJ基因的表达值。

4.6 统计分析

所有实验都进行了3次生物重复，每个处理收集5株植物进行分析。所有数据采用SPSS软件进行统计学分析（https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software），采用0.05显著性水平下的t检验。

5 补充材料

本文件的补充资料载于https://doi.org/10.1186/s12870-020-02476-3。

6 基金项目

本研究部分得到了广东省现代农业产业技术创新团队专项基金（No. 2019KJ122），浙江省自然科学基金（LY18C150008）， 国家自然科学基金（31872090），国家重点研究开发计划（2017YFD0101902），现代农业产业技术体系建设中国广东，浙江省国家重点实验室养殖基地可持续的病虫害控制项目（No. 2010DS700124-ZZ1807），中国农业研究系统专项基金（CARS-23-G44），浙江省级农业新品种育种重大科技项目（2016C02051）资助。