参苓白术散联合二甲双胍对糖尿病肥胖患者肠道菌群的影响及不良反应观察

蒋海燕,葛锁华,于雪冰,孙露阳,彭俊华

(1.江苏大学附属金坛医院检验科,江苏 常州 213200;2.江苏大学附属金坛医院内分泌科,江苏 常州 213200)

近年来,肠道菌群与疾病间的关系成为一个研究热点。研究表明,2型糖尿病(T2DM,type 2 diabetic mellitus)患者的肠道菌群与胰岛素抵抗(IR,insulin resistance)相关[1],调节机体肠道菌群可治疗T2DM[2]。中医认为糖尿病是由于机体脾胃亏虚、痰浊内生、阴火内伏而导致的[3],中医的“脾”可能与肠道菌群失调相关[4],因此,中医通过益气健脾、除湿升阳来治疗糖尿病。用健脾疏肝方联合针灸疗法,通过调节肠道菌群能有效治疗腹泻型肠易激综合征患者[4]。参苓白术散具有健脾、益气、渗湿的功效,通过调节肠道菌群的平衡,能有效治疗多种类型的腹泻[5-7]。二甲双胍通过调节肠道菌群治疗糖尿病[8],联合针刺能有效改善糖尿病早期患者的糖代谢[9]。通过参苓白术散与二甲双胍联合用药治疗T2DM肥胖患者,观察肠道菌群的改变、肠道菌群与糖化血红蛋白间的相关性及其用药后的不良反应情况,为中西医联合治疗T2DM提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象及标准

挑选明确诊断为轻中程度T2DM的肥胖患者84例,随机分为实验组和对照组。研究为前瞻性横断面设计,实验组用参苓白术散联合二甲双胍治疗,对照组用二甲双胍治疗,参照《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[10]标准诊断T2DM。将研究计划告知研究对象并签订同意书,研究方案经医院伦理委员会批准后执行。

入组标准:体脂指数(BMI,body mass index)≥25.0,空腹血糖≥7.0 mmol/L或随机血糖≥11.1 mmol/L,存在糖尿病临床症状。

排除标准:排除恶性肿瘤者、心肝肾功能受损者、消化系统自身免疫性疾病患者、用抗生素治疗者、腹泻患者、肠道疾病或肠道功能明显异常者、服用影响肠道菌群药物者、对参苓白术散或二甲双胍过敏者、治疗中依从性差及中途退出者。

实验组:男性23例,女性19例,平均年龄为(54.7±10.6)岁,平均BMI为(26.2±2.4)。对照组:男性22例,女性20例,平均年龄为(55.2±10.2)岁,平均BMI为(26.1±2.7)。2组在年龄、性别、BMI间没有统计学差异(P>0.05)。

1.2 治疗方案及分组

对所有入组参加实验者进行糖尿病知识宣教,制定治疗计划、告知并签订同意书,治疗时间持续6个月。治疗方案:对照组为二甲双胍(常州制药厂有限公司、国药准字号H20054786),口服,0.5 g/次、3次/日。实验组是在对照组用药基础上增加参苓白术散(北京同仁堂制药厂、国药准字号Z11020755),口服,6 g/次、3次/日。其他治疗方案2组均相同。

1.3 大便标本采集与BMI采集

分别于治疗开始、治疗1周、治疗3个月、治疗6个月时,用一次性棉签采集研究对象清晨排出的大便约50 g于无菌便盒中30 min内送检。分装约30 g大便,标记,-80 ℃保存。

用标准医用身高体重称计量研究对象的身高、体重,每次测量重复3次,取平均值,按BMI=体重(kg)/身高2(m2)计算。

1.4 血清空腹血糖、胰岛素及HbA1c的测定

分别于治疗前、治疗1周、治疗3个月、治疗6个月时采集研究对象的空腹静脉血,HbA1c用EDTA真空抗凝管采血并及时测定,其他标本用干燥真空管采血、经4 000 r/min离心并分离血清,置-80 ℃备用。空腹葡萄糖(FG,free glucose,贝克曼配套试剂)水平用贝克曼AU5800生化分析仪(美国)检测,空腹血胰岛素(Ins,insulin,贝克曼配套试剂)水平用贝克曼DX800I化学发光仪(美国)检测。糖化血红蛋白(HbA1c,配套试剂)水平用高效液相色谱法(HPLC)伯乐糖化血红蛋白测定仪(美国)检测。所有检测按试剂盒说明书操作,质控合格后测定样本。

1.5 肠道菌群DNA数量的检测

按实验所选3种肠道菌群各自的16S rDNA 基因序列合成引物[3],引物序列为:双歧杆菌:上游GGTTCTGAGAGGAGGTCCC,下游CCACATCCAGCATCCAC;拟杆菌:上游 CTGAACCAGCCAAGTAGCG,下游CCGCAAACTTTCACAAC-TGACTTA;肠球菌属:上游CCCTTATTGTTAG-TTGCCATCATT,下游ACTCGTTGTACTTCC-CATTGT。

大便DNA提取试剂盒(TIANGEN)按说明书操作,提取大便中肠道菌群基因组DNA。将3种标准菌株DNA分别制成108copies/mL、107copies/mL、106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL,作阳性DNA曲线。检测标本为提取的待测大便DNA,阴性对照用灭菌纯水代替DNA。取1.5 μL DNA、上游和下游引物各0.5 μL,再加入PCR试剂盒(ABI产品,美国)其他成分,构成25.0 μL反应体系,用Stepone Plus实时荧光定量PCR仪(ABI产品,美国)进行扩增反应。反应条件:样本先于95 ℃反应10 min,然后再以94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s 作用40个循环。扩增结束后,查看曲线并分析产物的特异性,根据仪器读取的荧光值、标准曲线及样品 Ct 值,仪器自动计算出样品中细菌DNA的含量。测定结果以每克大便中DNA拷贝数(copies)的对数值表示。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 T2DM肥胖患者用药治疗后血清FG、Ins及HbA1c水平

与同组治疗前比较,治疗后T2DM肥胖患者血液中FG和HbA1c水平降低、Ins水平升高;与治疗3个月比较,治疗6个月T2DM肥胖患者血Ins水平明显提高、血FG和HbA1c水平明显降低,均有统计学意义(P<0.05,见图1、表1)。与对照组同时相点比较,实验组在治疗3个月时T2DM肥胖患者血FG和HbA1c水平明显降低、血Ins水平明显增高(P<0.05,见图1、表1)。

注:a表示与同组治疗前比较P<0.05;b表示与同组治疗3个月比较P<0.05;c表示与同组治疗3个月比较P<0.05;1表示与对照组同时相点比较P<0.05。

表1 T2DM肥胖患者用药后肠道菌群中细菌DNA数量及血HbA1c的改变(n=42)

2.2 T2DM肥胖患者用药后肠道菌群中细菌DNA数量的改变

与同组用药治疗前比较,治疗3个月后T2DM肥胖患者大便中双歧杆菌及拟杆菌的DNA数量明显增多,治疗6个月大便中双歧杆菌及拟杆菌的DNA数量较同组治疗3个月明显增多(P<0.05,见表1)。同组比较,肠球菌DNA数量在治疗后呈降低趋势,治疗6个月后明显低于用药前(P<0.05)。与对照组同时相点比较,实验组用药6个月T2DM患者大便中双歧杆菌及拟杆菌的DNA数量明显升高、肠球菌DNA数量明显降低,实验组双歧杆菌在用药3个月时明显增加(P<0.05,见表1) 。

2.3 T2DM肥胖患者血HbA1c水平与肠道菌群DNA数量间的相关性

经Spearman相关分析,T2DM肥胖患者血清中HbA1c水平与大便中双歧杆菌 DNA数量(r=-0.611,P=0.017)、拟杆菌DNA数量(r=-0.327,P=0.013)呈负相关,与大便中肠球菌 DNA数量(r=0.237,P=0.036)呈正相关。

2.4 T2DM肥胖患者联合用药后的不良反应事件

在实验过程中,观察到患者用药后出现便秘、恶心呕吐、乏力倦怠、肝肾功能受损等不良反应事件,其中实验组分别为3人、2人、2人、0人,对照组分别为2人、3人、4人、1人,2组间没有明显差异(χ2=2.59,P=0.63)。

3 讨论

随着人们生活方式的改变,全球肥胖、T2DM患者人数增长迅速,防治上述等慢性疾病的问题也日益突出。

正常人体肠道内定植着1 000多种、数量达1014个、质量约1.5 kg的微生物群落,统称肠道菌群。肠道菌群中微生物种类、数量等的改变,即肠道菌群失衡,会引发机体免疫功能、条件致病菌与炎症因子的改变,宿主能量代谢发生变化,导致机体出现多种疾病,如炎症性肠病、糖尿病、慢性肥胖、炎症脂代谢异常、心血管疾病、肿瘤等[11]。

二甲双胍是指南[10]中推荐的首选治疗糖尿病药物,二甲双胍能够调节肠道菌群、增加益生菌如布劳特菌和粪肠杆菌的数量[8]、增加短链脂肪酸的含量,更好地发挥降血糖、降血脂、减体重的作用[9,12-13]。研究发现,二甲双胍治疗T2DM肥胖患者,对照组在用药治疗后患者血液中FG水平明显降低、Ins水平明显增高,且治疗3个月后T2DM肥胖患者大便中双歧杆菌的DNA数量明显增多、血HbA1c水平明显降低,治疗6个月时T2DM肥胖患者大便中肠球菌数量明显降低、拟杆菌数量明显增多。这些结果表明,二甲双胍具有很好的降血糖、提升胰岛素水平的作用,治疗达到一定时间后,能改变肠道菌群的结构,使双歧杆菌和拟杆菌数量明显增多,肠球菌数量减少,表明二甲双胍通过调整肠道菌群的结构起到了治疗糖尿病的效果[8,13]。

肠道菌群是中药治疗糖尿病的潜在靶点,所调节肠道菌群主要包括:增加肠道菌群的多样性、降低硬壁菌/拟杆菌值[14];增加抗炎症细菌数量,如双歧杆菌、乳酸杆菌、艾克曼菌、粪杆菌等[15];增加产短链脂肪酸的细菌[15];减少病原性细菌数量,如大肠埃希氏菌及肠球菌等[13]。最终通过抗炎症作用、抗氧化作用、保护肠道屏障、抑制脂毒性等多个方面在治疗T2DM中发挥效果[16]。参苓白术散中含有人参,而人参多糖和人参皂苷Rb1具有抗糖尿病效果[17]。参苓白术散具有益气补脾、化湿止泄的功效,能有效治疗脾虚型腹泻[5]、抗生素致菌群失调性腹泻[6],具有调整肠道菌群结构、提高益生菌构成的作用[7,14]。含人参、白术、茯苓的方剂参术调脾散通过减少肠球菌数量、降低硬壁菌/拟杆菌值能有效治疗T2DM[15]。研究发现,与对照组同时相点比较,实验组在治疗3个月后 T2DM肥胖患者血糖和HbA1c水平及治疗6个月时大便中肠球菌DNA数量明显降低,实验组在治疗3个月后血Ins、大便中双歧杆菌的DNA数量明显增高,但实验组与对照组间总的不良反应没有差异。这些结果表明,实验组治疗糖尿病效果更佳,且调整肠道菌群的作用也优于对照组。相关分析的结果显示,T2DM肥胖患者血HbA1c水平与大便中双歧杆菌和拟杆菌的DNA数量呈负相关、与肠球菌的DNA数量呈正相关,说明通过调整肠道菌群的构成可以治疗糖尿病,且联合用药(实验组)优于单用药物(对照组),进一步证明通过调节肠道菌群可治疗糖尿病。

总之,中西药联合治疗T2DM肥胖患者能有效降低患者FG和HbA1c的水平、提高血Ins水平,治疗效果优于单用二甲双胍,这种治疗效果可能与调节患者的肠道菌群、特别是提高大便中有益菌如双歧杆菌和拟杆菌数量、降低病原性细菌如肠球菌数量相关。