仔猪肠道免疫与肠道健康

韩若婵，左玉柱,赛力克·巴合达吾列提，梁 琳，崔尚金

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京，100193；2.西北农林科技大学医学院，陕西 杨陵，712100；3.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；4.新疆阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心 新疆 阿勒泰，836500)

肠道黏膜免疫系统是动物全身最大的淋巴器官，主要指肠道相关淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissue, GALT)。肠道相关淋巴组织主要包括派氏集合淋巴结(Peyer’s patches, PP)和肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)，二者共同激活肠道的免疫反应[1]。肠道淋巴细胞包括固有层中的淋巴细胞(PL)和肠上皮内淋巴细胞(IEL)，是免疫反应的效应部位[2]。肠道免疫系统通过体液免疫和细胞免疫共同作用，阻止内毒素和有害微生物入侵肠道，清除机体识别的抗原物质，从而维持正常的肠道屏障功能。派氏集合淋巴结是T细胞分化和增殖的第一场所，通过和其他免疫细胞的相互作用，诱导免疫耐受，抵抗病原菌的感染。肠系膜淋巴结是一群位于肠系膜内的大淋巴结，肠道内抗原对MLN的发育至关重要，如断乳前后，肠内抗原迅速增多，导致MLN迅速发育。固有层是发生肠道免疫应答的效应部位，含有丰富的免疫细胞，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等，这些免疫细胞是维持肠道稳态平衡的重要调节者。肠上皮内淋巴细胞以CD8+T细胞为主，与传统细胞毒性T淋巴细胞不同，IEL细胞具有调节肠道平衡、维持上皮细胞屏障功能及调节获得性和天然免疫应答等功能的特点。

1 仔猪肠道黏膜免疫系统特点

成年猪的派氏集合淋巴结、小肠绒毛外部和小窝具有高度分化的免疫组织结构。派氏集合淋巴结和肠系膜淋巴结最先接触进入体内的抗原，增殖分化生成相应的T淋巴细胞和B淋巴细胞，进入到肠道的片层结构中，发挥其免疫效应功能。肠道黏膜上也存在大量的免疫细胞，并具有相应的免疫功能。其中，CD8+细胞毒性T细胞分布在黏膜上皮内和上皮下层中，CD4+辅助性T细胞分布在固有片层中。基质细胞（主要的上皮细胞）和树突状细胞表面还表达大量的组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子（T细胞识别的抗原）。人类和啮齿动物MHC-Ⅱ类分子主要表达于基质细胞和树突状细胞上，但猪肠道小窝内T细胞的表达量却很高。

刚出生的仔猪，除了没有内在的循环抗体外，其黏膜免疫系统发育也不完全，在出生后的一段时间内才能建立起来。此过程可分为四个阶段。新生阶段：仔猪的小肠上皮内淋巴细胞较少，黏膜淋巴细胞开始聚集并形成派氏集合淋巴结，但与成年动物的T细胞聚集区域相比，此时仔猪的淋巴集结还没有形成明显的免疫组织结构。出生后第2周：小肠内淋巴细胞快速集结，这些细胞表面存在CD2+，但还没有CD4和CD8。派氏集合淋巴结在此阶段开始形成正常的组织结构。2～4周龄的仔猪：小肠黏膜上CD4+T细胞开始聚集，但仍缺乏CD8+细胞，开始出现少量B细胞，并开始分泌IgM。5周后：小肠上皮内出现CD8+细胞，在肠道小窝内可分泌IgA的B细胞也开始出现。7周后小肠的各种结构基本达到成年动物的水平[3]。

肠道内出现的细菌对黏膜免疫的建立起着重要作用。悉生动物出生后体内很快出现CD2+细胞，但生长后期CD4+、CD8+细胞却没有出现，并且派氏集合淋巴结的大小比普通动物和SPF动物小，分泌IgM的B细胞也多于分泌IgA的B细胞。说明肠道内B淋巴细胞的增生需要某些微生物的刺激，并且细菌对黏膜免疫的影响大于对机体免疫系统的影响，对分泌IgM和IgA的影响也存在这种差异。

肠道细菌促进黏膜免疫系统建立的途径有两种：第一，免疫效应细胞因细菌的（也可以不是真正的致病原）刺激而大量聚集，这是一个独立的控制机制。第二，细菌促进黏膜免疫系统逐渐建立起一个效应与调节平衡的机制。机制的建立需要经历一个特定的发展阶段，不同亚型的T细胞相继出现以维持效应与调节功能之间的平衡[4]。仔猪出生后自身黏膜免疫系统通过效应与调节功能的发展，在一定范围内保持平衡；一旦平衡被破坏，就会造成黏膜损伤。通过此平衡模式，可以预测新生仔猪免疫功能所受到的各种影响。

此外，肠道黏膜免疫系统也受环境因素的控制。肠道黏膜内的免疫效应细胞和记忆细胞都依靠其自身的微生物环境而存活，比普通免疫细胞更易发生凋亡。在派氏集合淋巴结和肠道黏膜内，效应性T细胞和调节性T细胞相互协调作用，能够准确识别环境中出现的每一种抗原，做出正确的反应。在肠道黏膜中存在大量T细胞时，意味着机体的免疫正在对无害的食物抗原和有益的共生细菌产生免疫耐受，而不是发动免疫反应。

2 黏膜耐受和主动免疫反应

肠道黏膜耐受对新生仔猪的健康非常重要。肠道相关淋巴样组织在仔猪出生和断乳后会持续接触食物中各种抗原成分和通过肠道途径进入的各种微生物，并能有效区分病原菌和食物抗原成分，一方面对侵入的病原菌做出及时有效的免疫应答，另一方面又能避免对共生菌和食物蛋白发生免疫反应。衡量肠道的健康标准，就是看肠道是否具有快速有效区分有害和无害物质的能力，和能否准确做出相应反应的能力。

口服耐受是机体免疫系统对口服抗原产生的特异性无应答或低应答状态。如3周龄仔猪在断乳后第2天饲喂以大豆为基础的饲料，可在血清中检测到大豆蛋白β-conglycinin，如果血液中吸收的蛋白达到一定浓度（80 ng/mL），就会刺激仔猪快速产生针对大豆蛋白的抗体IgG。这种反应与同日龄仔猪注射含有佐剂大豆蛋白产生的免疫反应相同，但两个反应明显受控于两个不同的免疫机制。如果新生仔猪曾经接触过大豆蛋白，再次饲喂时免疫反应就会受到抑制，但不会影响到通过注射产生的免疫反应。对于正常的食物蛋白，肠道黏膜免疫系统主要通过由抗原特异性T细胞克隆无能或缺失（clonal anergy or deletion）和免疫细胞介导的主动抑制等机制诱导口服耐受，来防止对食物蛋白的免疫应答反应。口服抗原能激活各种类型的调节性T（Treg）细胞，在肠道免疫系统中，与其他辅助性T细胞相比，Treg细胞的分化呈优势状态，其分布广泛，在肠道黏膜和淋巴结中均大量存在。Treg细胞主要通过抑制效应T细胞和抗原提呈细胞的功能，在维持肠道免疫耐受中发挥关键作用。Treg细胞产生的抑制性细胞因子主要包括IL-10、TGF-β和IL-35[5]，这些细胞因子可抑制效应T 细胞功能的发挥，从而导致免疫耐受的形成。此外，肠道树突状（DC）细胞在维持口服耐受中发挥重要作用。口服耐受是一个复杂的网状结构，涉及到多种细胞和分子机制。除DC和Treg细胞外，还有其他细胞参与口服耐受的形成。因此对口服耐受的机制研究仍是今后的研究热点。

不但口服蛋白可以引起免疫耐受，肠道共生细菌所产生的某些物质也可以引起免疫耐受，一旦破坏这种耐受则会导致肠道炎症的发生。肠道共生菌的主要功能是维持肠道免疫系统的平衡，调节宿主代谢，促进营养物质更好地被利用，并帮助宿主机体抵御外来微生物的入侵。GALT对共生菌的耐受主要是由共生菌自身的特点、小肠上皮细胞的特性及肠道黏膜固有层内免疫细胞的特点3个方面的因素所决定。第一，共生菌与致病菌不同，不能表达黏附、侵入因子及黏蛋白酶，共生菌定居肠道的能力较弱。第二，小肠上皮细胞的模式识别受体不能直接和共生菌接触，如表达在上皮细胞基底外侧的TLR5与上皮细胞顶侧的共生菌无法直接接触，因此不能有效地识别共生菌的PAMP。TLR能识别病原菌，并介导NF-κB的活化，引起肠道炎症反应，而共生菌能通过活细胞核受体过氧化物酶体增殖子活化受体γ （peroxisome-proliferator-activate receptor-γ, PPAR-γ）抑 制NF-κB的活性。第三，从肠道黏膜固有层的特点来看，固有层内含有特殊的耐受性DC、Treg和巨噬细胞，无法引起对共生菌的炎症反应，其识别病原菌主要是通过TLR5和细胞因子的分泌[6]。这些免疫细胞可以产生许多抗炎症的细胞因子（如IL-10和TGF-β）抑制共生菌的固有炎症反应，维持肠道内环境的稳定[7]。此外，共生菌可以促进肠系膜淋巴结和派氏集合淋巴结中的CD4+Foxp3+Treg细胞的增殖，使机体对共生菌产生免疫耐受。肠道黏膜免疫系统对共生菌的耐受性对维持肠道免疫平衡至关重要。

3 断乳对仔猪免疫系统的影响

母乳是仔猪断乳前营养、抗体和其他生理活性物质的唯一或最基本的外部来源，除了为仔猪的发育提供能量、蛋白质、脂肪酸、维生素和矿物质等基本营养外，还提供一些有益的活性物质。此外，初乳和常乳中的乳源生长因子、激素及其他活性物质对出生后仔猪胃肠道的分化和发育具有重要作用，断乳会对仔猪的肠道和黏膜免疫系统造成很大影响。在断乳后24 h内仔猪小肠绒毛会变短，4～5 d后严重影响到肠道内的微生态平衡。这个阶段，肠道内CD2+淋巴细胞明显增多，肠道小窝内的细胞转化率在断乳前1～2 d明显降低，而后又明显升高。断乳后，仔猪对皮下注射促淋巴有丝分裂原（植物血凝素）的反应能力也明显降低，而断乳后1 d与断乳后2周相比，仔猪对绵羊红细胞刺激产生抗体的能力也明显降低。这是由于体内T细胞分泌IL-2减少，导致T细胞分裂受到抑制。随着断乳仔猪IL-2的产量的下降，促使其肠道内发生主动的免疫反应，或产生应激反应促使机体释放出类固醇和组胺。断乳仔猪体肠道固有层内的T细胞也会受到这种影响。目前，对仔猪在断乳的过程中出现皮质激素改变的研究很少，断乳对仔猪皮质激素的影响值得关注。其他因素如短暂的食欲下降也会引发黏膜发生炎症。

连续调查从出生到7周龄的仔猪肠道菌群变化，发现从完全母乳喂养到固体饲料的日粮转变是影响肠道菌群变化的主要因素。宏基因组分析发现断奶前后多糖降解通路的丰度有显著改变，断奶前降解乳汁中多糖相关的通路丰度较高，断奶后降解植物多糖的通路较高。在日粮保持不变的情况下，仔猪肠道菌群处于较为稳定的状态。而仔猪肠道对日粮抗原过敏从而导致肠道损伤是断奶后腹泻的原发因素，病原微生物感染只是仔猪断奶后腹泻的继发性原因[8]。大豆类抗原是断奶仔猪发生过敏的首要诱因[9]，特别是热稳定性大豆抗原蛋白[10]。大豆抗原蛋白诱发仔猪过敏反应，损伤肠道黏膜，提高肠道通透性，促使sIgA的合成[11]。

断奶后的仔猪肠道黏膜其免疫功能处于不稳定的状态，不同日龄的断奶仔猪其肠道黏膜的免疫功能有差异。断奶初期，仔猪肠道黏膜损伤、DC功能紊乱，肠道黏膜免疫系统中的细胞因子分泌发生变化。断奶导致的仔猪肠道黏膜Th1型促炎性细胞因子分泌增多，T淋巴细胞亚群数量发生改变[12]；肠道黏膜形态发生的改变，主要表现为肠绒毛变短和隐窝深度增加[13]。断奶初期的仔猪，其肠上皮细胞紧密连接蛋白（Occludin）的mRNA表达量有所下降，从而造成肠道黏膜通透性增强[14]，但是这种紊乱一般是暂时性的，随着断奶后期仔猪肠道微生物区系趋于稳定，肠道黏膜免疫功能也逐渐恢复正常。初生仔猪肠道黏膜和T细胞等结构尚未发育成熟，肠绒毛中几乎没有CD4+T淋巴细胞的表达[12]，而仔猪断奶后自身肠道黏膜免疫因子迅速变化，激发肠道黏膜免疫功能，从而导致仔猪肠道黏膜免疫细胞功能的紊乱，一般至断奶后期逐渐缓解。所以相较于初生仔猪与成年猪，断奶仔猪的肠道黏膜免疫功能最不稳定，断奶仔猪的肠道最易患病。

4 结论

为了维持肠道健康，机体的免疫系统就必须对各种抗原物质（有害或是无害的）做出正确反应，而不能简单的对“非自身”抗原做出主动免疫反应。虽然还不太清楚这些机制，但人们已经对肠道黏膜上的淋巴结（派氏集合淋巴结和肠系膜淋巴结）和小肠绒毛上的免疫结构有了详细的认识。新生仔猪的免疫结构发育还不健全，只有到5～7周后才能发育完全，这就意味着新生仔猪和断乳仔猪的免疫力比较低下，需要微生物促进其免疫能力的提高。断乳是猪生命周期中的一个关键阶段，断乳不当常常导致仔猪发生严重的肠道感染，并导致饲养过程中抗生素过度使用等问题。断乳时会有很多因素影响到仔猪的免疫能力，进而影响到仔猪对食物、共生细菌和病原微生物的免疫反应。断乳时机体产生的不当免疫反应，常会损害肠道的消化吸收功能，并造成疾病。仔猪在3周时免疫系统发育还不成熟，因此在仔猪5周后断乳较为适宜。

对于断乳阶段的仔猪来说，黏膜免疫系统的稳定对于建立正常的黏膜免疫耐受和肠道共生菌群是非常重要的。免疫系统、日粮结构和共生菌群之间的相互影响是非常复杂的，是几百万年脊椎动物与自然环境不断的共同进化所形成的，一旦发生某种改变就会影响到相互之间的稳定性。近些年来研究发现，环境生活方式对孩子的过敏发生率具有明显的影响。比如在交通繁忙或是有工业污染的地区，过敏的发生率不高，在农村过敏发生率也低，这可能与动物密切接触相关。令人惊讶的是，如果在孩子体内检测到两种或两种以上肠道病原的抗体，过敏发生率也比较低。根据这些统计结果，可以提出了一个“卫生假设”，必要的细菌抗原刺激，对建立一个有效的能够区分“无害”和“有害”抗原的免疫系统非常必要。这个提议对养猪生产也同样具有现实意义。因为新生仔猪黏膜免疫系统的发育不如婴儿完全，而在更短时间内就要发育到成年猪的水平，这就需要更进一步探究仔猪生长过程中细菌刺激的必要性和可行性。

肠道黏膜免疫对于仔猪肠道和机体健康发挥着重要的作用。在商品化养猪生产中，衡量仔猪黏膜免疫系统的功能，以及对日粮和细菌抗原的反应能力，能够预测断乳对仔猪产生的影响。探究仔猪肠道免疫与肠道健康之间的关系，对仔猪实施科学断乳，是未来养猪生产的必然趋势，将有助于提高仔猪免疫机能，增强猪群的生产性能，推动养猪业的良性发展。