复方老鹳草胶囊的提取工艺研究*

周怡雯，于清峰

(1 江南大学药学院，江苏 无锡 214122；2 中国药科大学理学院，江苏 南京 211198)

复方老鹳草胶囊制剂是由老鹳草、筋骨草、伸筋草三种中药材组成，临床上可用于祛风湿，治疗风湿麻痹、风湿性关节炎及类风湿性关节炎等疾病。老鹳草是常用中药，为牻牛儿苗科植物牻牛儿苗ErodiumstephanianumWilld.、老鹳草G.wilfordii或野老鹳草GeraniumcarolinianumL.的干燥地上部分[1]，具有祛风湿、通经脉、止泻痢、抗氧化、抗菌抗病毒的作用[2-3]，其所含主要化学成分包括黄酮类、鞣质、挥发油和有机酸等，多年的临床医疗实践证实了其在风湿性疾病上的良好功效[4]。筋骨草的主要有效成分为环烯醚萜类，而哈巴苷与乙酰哈巴苷是其中研究较多且有明显抗病毒、抗肿瘤活性的成分之一，其具有抗氧化、抗疟、抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖、收缩血管等药理活性[5-7]。伸筋草是石松科植物石子藤的全草[8]，具有抗炎、镇痛、抗菌、抑制乙酰胆碱酯酶活性、有效减少体内炎性细胞因子产生等作用，临床常用于治疗类风湿性关节炎、颈椎病和急慢性软组织损伤等疾病[9]。

本文是利用正交实验设计方法对复方老鹳草胶囊的最佳提取工艺进行筛选。实验中主要研究了乙醇浓度、溶媒用量、提取时间、提取次数这四个因素对复方老鹳草胶囊提取工艺的影响。正交实验设计是为寻求最优化水平组合的一种高效的多因素多水平实验设计方法，广泛应用于中药复方的提取工艺优化筛选等方面[10]。本实验首先考察了乙醇浓度的单因素考察，然后进行了正交实验，通过对得到的浸膏产率和乙酰哈巴苷含量的综合评分，最后找出并验证了得到的最佳提取工艺。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

HH-S数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司；ZK-82B真空干燥箱，上海市实验仪器总厂；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器责任有限公司；RE52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；AL204电子分析天平，梅特勒-多利多仪器(上海)有限公司；DT-100电子天平，美国双杰兄弟(集团)有限公司。

老鹳草，伸筋草，筋骨草，本地药材市场，经鉴定老鹳草为牻牛儿苗科植物牻牛儿苗的干燥地上部分，伸筋草为石松科石松属植物石松(LycopodiumjaponicumThunb.)的干燥全草，筋骨草经鉴定为唇形科植物金疮小草(AjugadecumbensThunb.)；乙酰哈巴苷对照品(纯度>99.9%，批号111925-201801)，中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯)，药用乙醇(95%)，南京化学试剂有限公司。

1.2 标准溶液的配制

乙酰哈巴苷标准溶液的制备：精确称取干燥恒重的乙酰哈巴苷标准品20 mg置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶液适量溶解稀释至刻度线并摇匀，即得乙酰哈巴苷标准溶液(0.2 mg/mL)。

1.3 提取工艺

称取老鹳草、伸筋草、筋骨草各10 g，置于圆底烧瓶中，加入不同浓度的乙醇回流，过滤，滤液旋蒸除去大量溶媒，将剩余溶液倒入已称重的蒸发皿中，水浴除去水分。经过真空干燥、冷却至室温，称重，计算浸膏得率。取干浸膏适量，加甲醇超声处理30 min，使其溶解于甲醇，定容至一定体积，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液经HPLC-UV测定乙酰哈巴苷含量。

1.4 液相色谱条件

色谱条件为：Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-水(13:87，V/V)，流速1.0 mL/min，紫外检测器，检测波长为207 nm。

1.5 正交优化实验

实验考察了乙醇浓度、溶媒用量、提取时间、提取次数四个因素，先后通过单因素实验以及L9(34)正交设计实验，以提取液中测得的乙酰哈巴苷含量以及浸膏得率为实验指标，研究各因素对提取工艺的影响程度及找出提取复方老鹳草胶囊的最佳工艺，实验因素与水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 乙酰哈巴苷标准曲线的绘制

表2 标准曲线数据

分别精确量取乙酰哈巴苷标准溶液50、100、200、300、400 μL加甲醇至500 μL，摇匀，静置，以制备0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的乙酰哈巴苷溶液。分别用HPLC-UV检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线(图1)，得标准曲线方程：A=5146.65C+21.48，R2=0.9991。

图1 乙酰哈巴苷标准曲线

2.2 供试品溶液的制备及阴性对照

筋骨草所含有效成分为环烯醚萜类，其中乙酰哈巴苷的含量最高。分别称取老鹳草、伸筋草、筋骨草各10 g，置于圆底烧瓶中，用200 mL，50%的乙醇回流2 h，提取一次，经过滤、旋蒸、水浴挥干、真空干燥、研磨、超声溶解30 min后，经HPLC-UV测定得到相应谱图2(a)。同样称取老鹳草、伸筋草各10 g，经相同方法处理后通过HPLC-UV测定得到谱图2(b)。由图2(a)可知，乙酰哈巴苷在8.1 min出峰，而图2(b)在8.1 min处并无乙酰哈巴苷的峰，说明阴性对照溶液对乙酰哈巴苷测定无干扰，方法专属性较好。

图2 老鹳草、伸筋草、筋骨草醇提物(a)；老鹳草、伸筋草醇提物(b)液相色谱图

2.3 醇浓度的单因素条件考察

筋骨草中含有较高含量的乙酰哈巴苷，所以以乙酰哈巴苷的含量和浸膏得率作为主要评价指标，用于提取工艺条件的优选。本实验中采用溶媒用量为1:10，提取时间为2 h，提取次数为1次，考察不同乙醇浓度(40%、50%、60%、70%)对乙酰哈巴苷总含量和浸膏得率的影响，通过用HPLC-UV测定总乙酰哈巴苷的提取量，选用乙酰哈巴苷提取量最多的乙醇浓度为提取溶剂的浓度[11]。

结果表明(表3)，乙醇浓度在50%的条件下乙酰哈巴苷的含量和浸膏得率都最高，该浓度条件最好，因此正交实验中以50%为中心，选取40%、50%、60%三个浓度进行最佳提取工艺考察。

表3 醇浓度单因素实验结果

2.4 正交实验设计

2.4.1 正交实验

取老鹳草、筋骨草、伸筋草各10 g，共九份，按表1的因素水平和L9(34)正交表设计实验方案进行实验，测定所得的浸膏率和乙酰哈巴苷含量。

2.4.2 正交结果分析

考虑到浸膏得率和乙酰哈巴苷含量可能互相影响，因此用浸膏率及乙酰哈巴苷得率的综合评分寻找最佳工艺，将浸膏率的权重定为0.5，乙酰哈巴苷得率权重定为0.5，正交实验结果见表4。

表4 正交设计表L9(34)

方差分析见表5。

表5 方差分析表

对实验结果进行方差分析，表5表明各因素影响大小顺序为提取次数(D)>溶媒用量(B)>乙醇浓度(A)>提取时间(C)，优选的最佳工艺为A1B3C1D2，即采用40%乙醇，12倍溶媒用量，提取2次，每次1 h。

图3 正交因素对综合评分的影响

2.5 优选条件的验证实验

正交实验中由综合评分法筛选出最佳工艺A1B3C1D2，即40%乙醇，12倍量，提取2次，每次1 h。称取与正交实验同等量的药材，按照最佳工艺进行实验，平行2次，测得浸膏率、乙酰哈巴苷得率，检验此工艺是否稳定可行。

表6中验证实验结果证实A1B3C1D2醇提条件与正交实验结果相符，故将A1B3C1D2即40%乙醇，12倍量，提取2次，每次1 h，确定为最佳提取工艺条件。

表6 验证结果

3 结 论

本实验经单因素实验、正交设计实验得出老鹳草醇提的最佳工艺条件为A1B3C1D2即乙醇浓度为40%，溶媒用量为12倍量，提取2次，每次1 h。老鹳草提取结果影响最大的是提取次数，其次是溶媒用量，乙醇浓度和提取时间，经过工艺验证证明此工艺的稳定可行性。

本实验为复方老鹳草胶囊的提取研究提供了一定的依据，为工业化生产提供可靠的理论依据。