两种新型冠状病毒抗体检测试剂的临床应用评价

宁乐平，刘晓春△，姜伟豪，吴荣才，黄日江，阳文辉

1.广西壮族自治区人民医院检验科，广西南宁 530000;2.广西壮族自治区人民医院邕武院区检验科，广西南宁 530000

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传染性强，其核酸检测是目前诊断SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的金标准，但核酸检测存在假阴性率高、操作繁琐、耗时长、测定结果易受多种因素影响等缺点，而且核酸单项检测不能满足疫情期间对疑似病例快速筛查的要求。随着临床对COVID-19诊疗经验的积累，最新有研究指出，SARS-CoV-2抗体+核酸联合检测能够弥补核酸检测准确性的不足，而且基于胶体金免疫层析技术(GICA)检测SARS-CoV-2抗体突破了现有检测技术对人员、场所、仪器的限制，缩短检测时间，操作方便快速，在基层医疗单位及现场检测中被广泛应用[1-6]。本文对广州万孚生物科技有限公司(简称万孚)和英诺特(唐山)生物科技有限公司(简称英诺特)生产的GICA试剂检测SARS-CoV-2总抗体、IgM、IgG的能力进行评价。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月16日至3月1日在广西壮族自治区人民医院邕武院区经核酸检测阳性的COVID-19确诊患者69例作为确诊病例组，确诊患者均符合文献[2]诊断标准，其中男16例、女53例，平均年龄为(43.7±14.5)岁，从发病到采样时间最短为10 d，最长为46 d，平均(30.3±8.3)d。另选取同期在广西壮族自治区人民医院邕武院区排除SARS-CoV-2感染的38 例体检人员作为阴性对照组，其中男8例、女30例，平均年龄为(40.2±7.4)岁。阴性对照组为无COVID-19相关临床症状且经过两次鼻咽拭子核酸检测阴性(两次检测时间间隔至少1周)。确诊病例组和阴性对照组在性别及年龄分布方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究遵守国际协调理事会临床试验规范和赫尔辛基宣言，经医院伦理审查委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有研究对象均采集空腹静脉血3 mL，置于真空采血管内，静置待血液凝固，3 500 r/min离心10 min，取血清备用。采集研究对象鼻咽拭子进行SARS-CoV-2核酸的检测。

1.2.2SARS-CoV-2抗体检测 采用万孚生产的GICA试剂(批号：W19500206)检测血清SARS-CoV-2总抗体(不能区分IgG和IgM)，检测针对棘突蛋白(S蛋白)抗体。同时，采用英诺特生产GICA试剂(批号：20200205)检测血清IgG和IgM，检测针对S蛋白和核衣壳蛋白(N蛋白)抗体，该试剂可以区分IgG和IgM。检测操作步骤参考试剂说明书。

1.2.3SARS-CoV-2核酸检测 实时荧光定量聚合酶链反应仪(ABI Prism 7500)购自美国ABI公司，核酸提取试剂盒购自湖南圣湘生物科技股份有限公司(批号：202003)，使用湖南圣湘生物科技股份有限公司生产的Natch S全自动核酸提取系统进行核酸提取。扩增试剂盒购自湖南圣湘生物科技股份有限公司(批号：202007)，针对SARS-CoV-2 编码ORF 1ab 及N 蛋白基因的特异性保守序列为靶区域，进行了双靶标基因的设计。实时荧光定量聚合酶链反应检测体系包含有内源性的内标引物和探针，通过是否检出内标来判断标本是否合格，减少假阴性结果。

2 结 果

2.1万孚与英诺特试剂、核酸检测诊断效能比较 万孚总抗体和英诺特IgG联合IgM 的诊断效能比较见表1。确诊病例组中万孚总抗体、英诺特IgM、英诺特IgG、英诺特IgG联合IgM阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组中万孚总抗体、英诺特IgM、英诺特IgG、英诺特IgG联合IgM阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 万孚与英诺特试剂、核酸检测诊断效能比较

2.2万孚总抗体和英诺特IgM联合IgG诊断性能比较 万孚总抗体和英诺特IgM联合IgG一致性检验kappa值为0.918(P<0.05)，说明万孚总抗体和英诺特IgM联合IgG两种结果间的一致性程度好。见表2。

表2 万孚总抗体与英诺特IgM联合IgG诊断性能比较(n)

2.3阴性对照组中3例患者SARS-CoV-2抗体与核酸检测结果不一致 本研究阴性对照组中3例患者SARS-CoV-2抗体与核酸检测结果不一致，2例患者出现“两次核酸阴性+万孚总抗体阴性+英诺特IgM弱阳性+英诺特IgG阴性”的结果，1例患者出现“两次核酸阴性+万孚总抗体阴性+英诺特IgM阴性+英诺特IgG弱阳性”的结果。此外，确诊病例组有4例患者出现SARS-CoV-2核酸检测复阳，这4例患者的万孚总抗体均为阳性，说明患者体内存在针对S蛋白的抗体。

2.4确诊病例组SARS-CoV-2抗体出现与消失的时间 确诊病例组英诺特IgG抗体产生率100%。确诊病例组中，英诺特IgM最早转阴的时间为13 d，最长持续时间大于46 d，具体能持续多长时间有待后续随访跟踪。英诺特IgG最早小于10 d产生，最早25 d转阴。

3 讨 论

GICA试剂检测SARS-CoV-2抗体的方法，在流行病学调查的方面有其独特的优势。本研究使用万孚和英诺特生产的GICA试剂检测SARS-CoV-2抗体，灵敏度和特异度均较高，高于罗效梅等[7]采用的江苏美克医学技术有限公司生产GICA试剂检测SARS-CoV-2的IgM联合IgG的灵敏度(92.1%)、特异度(90.7%)，以及梁颖等[8]、SHEN等[9]报道的IgG联合IgM的灵敏度和特异度。可能与不同研究中的患者数量、人群不同有关。

抗体检测可以弥补核酸检测灵敏度的不足，但抗体检测也存在一定比例的“假阳性”。类风湿因子、补体、嗜异性抗体、溶菌酶、使用鼠抗体治疗等内源性因素，以及标本溶血、储存时间过长、凝固不全等分析前因素，都可以导致“假阳性”[6]。

阴性对照组中3例英诺特IgG和IgM与核酸检测结果不一致的可能原因如下：(1)2例患者英诺特IgM弱阳性，存在“初次感染载量极低的SARS-CoV-2并处于感染早期，病毒载量低于核酸检测下限，机体产生少量IgM，尚未产生IgG”的可能性，但是2例患者均无任何COVID-19的症状、CT无阳性表现、相隔1周的两次核酸检测阴性，综合考虑是英诺特IgM假阳性；(2)另外1例英诺特IgG弱阳性，可能存在“既往感染SARS-CoV-2，但已恢复或体内病毒被清除，免疫应答产生的IgG维持时间长，仍存在于血液中而被检测到”的可能性，但是该患者无任何COVID-19的症状、CT无阳性表现、相隔1周的两次核酸为阴性、万孚总抗体阴性，综合考虑是英诺特IgG假阳性。以上3例英诺特IgM或IgG假阳性，可能是检测N蛋白抗体的假阳性所致。英诺特试剂检测S蛋白和N蛋白的抗体，而万孚试剂检测S蛋白抗体。如果患者体内仅存在干扰N蛋白抗体的物质，就可导致万孚总抗体阴性而英诺特IgM或IgG阳性的结果。反之，如果患者只有针对N蛋白的抗体，万孚总抗体存在一定漏诊的风险。

SARS-CoV-2暴发于上呼吸道感染流行季节，hCoV-NL63，hCoV-OC43，hCoV-229E，hCoV-HKU1感染引起的上呼吸道感染患者可影响SARS-CoV-2抗体的检测结果[10-15]。被SARS-CoV-2感染过的患者体内是否存在与N蛋白或S蛋白有交叉反应的抗体，是抗体检测中面临的重要问题。S蛋白是介导病毒进入细胞内的关键蛋白[13]。ZHENG等[14]通过生物信息学技术推测 S蛋白可能是未来治疗性抗体和疫苗的潜在靶点。

本研究出现4例SARS-CoV-2核酸检测复阳的患者，万孚总抗体均为阳性，说明患者体内存在针对S蛋白的抗体。体内存在针对S蛋白的保护性抗体，还出现核酸检测复阳，考虑可能原因如下：(1)针对S蛋白的抗体不一定是保护性抗体；(2)针对S蛋白的抗体是保护性抗体，但是针对某一特定氨基酸序列的，而被万孚试剂检测出的S蛋白抗体不是针对这一特定的氨基酸序列。总之，抗体的“假阳性”问题，是限制抗体用于COVID-19确诊的关键因素。目前，抗体检测主要用于疑似病例的确诊或排除[4]。对于不满足疑似病例标准的病例，抗体不作为诊断和排除依据。

本研究受多种条件限制，存在许多不足之处。例如标本数量有限，可能对分析结果的准确性产生影响；其次，收集的病例多为确诊10 d以上的病例；另外，对于阴性对照组的假阳性病例追踪时间不够久，可能准确性不足。因此需要通过多中心、大规模的临床验证，进一步明确抗体检测在SARS-CoV-2感染诊断中的价值。