不同标本类型及冻存对新型冠状病毒抗体检测效力的影响*

贺建兰，李青峰，钟 晶，毕 雷，尚鹏程，汪 波，邢 燕，罗 涛，王玥莲，周 觅

成都市公共卫生临床医疗中心检验科，四川成都 610061

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，按甲类传染病管理,《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第七版)增加了抗体检测的内容，抗体检测在COVID-19诊疗过程中发挥了重要的作用[1-6]。因此，血清新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗体检测的准确性和可靠性对疾病的诊断、治疗至关重要。本研究拟对COVID-19确诊病例使用不同类型标本的特异性IgM和IgG抗体检测效力进行了初步探讨，并分析了标本冻存对检测结果的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年2—3月在成都市公共卫生临床医疗中心住院的COVID-19确诊病例58例，男33例，女25例，年龄29～88岁。将入选患者分为两部分，其中20例用于比较血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体水平，收集其入院当日同源血清、血浆标本20份，检测SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体的S/CO值；其余38例于入院当日采集静脉血并检测血清SARS-CoV-2 特异性IgG抗体，然后于-80 ℃冰箱保存，并于2020年3月取出血液标本，于室温下复溶，充分混匀后上机检测，期间无反复冻融。比较冻存前后血清IgG抗体水平差异。本研究经医院伦理审查委员会审核通过。

1.2研究方法 采用磁微粒和化学发光技术，按照间接法原理进行免疫检测。全自动化学发光免疫分析仪(美国贝克曼Access2)、试剂盒购自四川沃文特生物技术有限公司。首先将血清或血浆标本、分析缓冲液、生物素化的SARS-CoV-2抗原包被的链亲和素磁珠及碱性磷酸酶(ALP)标记的鼠抗人IgM/IgG抗体加入反应管中孵育，形成“免疫磁珠-SARS-CoV-2 IgG抗体-酶结合物”复合物，再通过洗涤，将未被结合的酶结合物及其他物质去除。然后，加入发光底物(AMPPD)，酶结合物催化发光底物发射光子，光子的数量与标本中SARS-CoV-2 特异性IgM和IgG抗体水平呈正相关。

1.3标本采集 所有研究对象均采集空腹静脉血5 mL，分别置于含分离胶和含枸橼酸盐的采血管内，静置待血液凝固，2 500×g离心5 min分离血浆。分别收集血清或血浆备用。

1.4SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测 SARS-CoV-2 特异性IgM和IgG抗体检测遵照化学发光免疫分析仪操作指南。全自动化学发光测定仪器根据校准品的相对发光强度(RLU)自动计算阳性判断值(cut-off值)。阴性(-)：S/CO值<1.00，待检标本中未检出SARS-CoV-2 特异性IgM或IgG抗体；阳性(+)：S/CO值≥1.00，待检标本中检出SARS-CoV-2特异性IgM或 IgG抗体。

1.5统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行数据统计分析，SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体S/CO值采用秩和检验,非正态分布资料以M(P25～P75)表示；变量间相关性采用Spearman相关性分析法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1COVID-19确诊患者同源血清与血浆IgM和IgG抗体S/CO值比较 Spearman相关性分析显示，血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM抗体相关系数(r)=0.999 6，SARS-CoV-2特异性IgG抗体r=0.976 7，SARS-CoV-2特异性IgM抗体拟合线斜率为1.060(95%CI：1.045～1.068)，SARS-CoV-2特异性IgG抗体拟合线斜率为1.086(95%CI：1.011～1.161)，提示血清和血浆的S/CO值均呈线性相关，见图1。血浆 SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体的S/CO值均略高于血清。血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM抗体的S/CO值比较，差异有统计学意义(P=0.000 2)；血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgG抗体的S/CO值比较，差异有统计学意义(P=0.005 6)。血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体阳性标本数相同，配对结果一致，表明该差异并不影响定性结果判读，定性分析结果也相同，见表1。

注：A为血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM抗体的 S/CO值关系分析；B为血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgG 抗体的S/CO关系分析。

表1 血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体的S/CO值分析及定性结果

2.2冻存前后标本SARS-CoV-2特异性IgG抗体S/CO值关系分析 Spearman相关性分析显示，冻存前后标本SARS-CoV-2特异性IgG抗体的S/CO值具有相关性(r=0.984 5，P<0.05)，斜率仅为0.748 1(95%CI：0.711 9～0.784 3)，见图2。同时，定性分析中也出现2例标本在冻存前SARS-CoV-2特异性IgG抗体检测为阳性，而在冻存后SARS-CoV-2特异性IgG抗体检测为阴性。

图2 冻存前后血清标本SARS-CoV-2特异性IgG抗体的S/CO值关系分析

3 讨 论

《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》针对COVID-19诊断标准新增了如下内容：(1)确诊病例第三条血清SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体阳性，血清SARS-CoV-2特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高；(2)COVID-19疑似病例排除标准为疑似病例连续2次呼吸道病原核酸检测阴性(采样时间至少间隔24 h)，且发病7 d后SARS-CoV-2特异性抗体IgM和IgG抗体仍为阴性[6]。有研究表明，IgM和IgG抗体联合检测对COVID-19的诊断、疗效固体及预后均具有价值[7-10]。徐万洲等[11]研究表明，血清SARS-CoV-2 特异性IgM和IgG抗体联合检测可作为SARS-CoV-2感染的有效筛查和诊断指标，是COVID-19核酸检测假阴性的有效补充。唐鹏等[12]研究比较了化学发光和胶体金法检测SARS-CoV-2特异性抗体的阳性检测值等，提出在COVID-19的诊疗过程中，抗体的检测可以辅助弥补咽拭子核酸检测的不足，化学发光法测定总抗体优于胶体金法。

在对SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测时，除了需要选择灵敏度和特异度较好的检测试剂盒外，标本类型也非常重要[13-15]。有研究表明，在登革热病毒的检测中，血清和血浆标本同样有效[8]。本研究通过比对COVID-19确诊患者同源血清与血浆SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体S/CO发现，血清和血浆SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体均存在高度相关性，拟合线斜率接近1.0，且定性分析结果完全一致。本研究结果表明，血清和血浆标本具有同样的检测效力，但需要注意的是，血清和血浆标本SARS-CoV-2特异性IgM抗体存在一定差异，尽管在本研究中并未影响定性分析，但在大样本量的临床实践中仍有出现差异的可能，差异原因有待进一步研究。

本研究结果显示，即使在-80 ℃冻存，且避免反复冻融的理想情况下，仅仅保存3周，标本S/CO明显下降且有2个标本出现了定性分析的偏差。因此，为保证检测结果的准确性，应尽量选择新鲜血液标本进行SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体检测。