广西壮族人群LINC01133基因多态性分布研究*

石 凤，王俊利

右江民族医学院附属医院生殖医学中心，广西百色 533000

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt的不能编码为蛋白质的RNA，主要定位于细胞核，表达水平低。lncRNA在不同的生理和病理过程中起着重要的作用，包括表观遗传控制、基因转录、转录后修饰及染色质结构和核转运的调节[1]。lncRNA的主要功能是作为ceRNA网络与microRNA竞争性结合调控靶基因的转录和修饰[2]。已有研究表明，lncRNA表达紊乱可引起多种肿瘤的发生，包括前列腺癌、肝癌、乳腺癌和鼻咽癌等[3-5]。前期研究发现编码RNA及非编码microRNA的基因突变会引起基因表达水平改变，LINC01133基因在肿瘤的发展和转移中起着重要作用[6-10]。本研究拟采用多重高温连接酶检测反应(iMLDR)和DNA测序技术检测广西壮族人群LINC01133基因多态性位点rs76477312和rs2840587分布情况，并与ensemble数据库中公布的千人基因组计划进行对比，为后续在不同人群中LINC01133基因多态性与疾病易感性及群体遗传差异性疾病的研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018-2019年在右江民族医学院附属医院体检健康的广西壮族人群574例作为研究对象，男性275例、女性299例，年龄16～78岁，所选人群之间无血缘关系，长期居住在广西地区，各项实验检测指标均在正常范围内，既往无慢性病史、肿瘤病史。该研究经研究对象知情同意并经右江民族医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1DNA提取 清晨空腹采集志愿者全血2～5 mL于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管，轻轻摇晃混匀，采用深圳亚能公司DNA提取试剂盒，按照操作说明书提取全基因组DNA，并于-70 ℃冰箱保存待用。

1.2.2PCR引物设计及反应体系 查阅美国国立生物技术信息中心数据库中LINC01133基因多态性位点rs76477312和rs2840587的碱基序列，根据在线引物软件设计LINC01133基因多态性位点的扩增引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs76477312正向引物为5′-GCC CAT TAC CGG TTT TAA CTC TCC-3′，反向引物为5′-CTT GAG GAA CGT ACA ATG GGA GTC A-3′；rs2840587正向引物为5′-CCA CAA CAG TCC CCG GTG T-3′，反向引物为5′-CTC CAT CAT GAA ACT GCC CAC AC-3′。PCR反应体系(20 μL)包括：1 μL样本DNA，1 μL多重PCR引物，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaq缓冲液，2 U 3.0 mmol/L Mg2+，1 U HotStarTaq聚合酶(Qiagen Inc.公司提供)，剩余体积用超纯水补足。连接反应体系：10×连接缓冲液 1 μL、5′连接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，高温连接酶 0.25 μL、3′连接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μL、纯化后多重PCR产物 2 μL、ddH2O 6 μL 混匀。连接反应程序为94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，共计38个循环。

1.2.3iMLDR多重单核苷酸多态性(SNP)分型 先采用多重PCR将目标基因多态性位点所在区段在一个体系中获得扩增。扩增产物经外切核酸酶及虾碱酶(ExoⅠ/SAP)纯化后用于后续连接酶反应的模板。在一个连接反应中，每个位点包含两个5′端等位基因特异探针及紧挨其后的一条3′端位点的荧光标记的特异探针。连接产物通过ABI3730XL的毛细管电泳来区分。原始数据文件用GeneMapper4.1软件来分析，委托上海天昊生物科技有限公司进行该研究。

1.3统计学处理 采用哈迪-温伯格遗传平衡定律检测该研究对象是否来自于同一群体。LINC01133基因多态性位点rs76477312和rs2840587的基因型和等位基因例数由SPSS17.0得出，不同人群的LINC01133基因多态性两位点的基因型、等位基因频率比较均由SPSS17.0的χ2或Fisher精确检验计算，检验水准α=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1rs76477312和rs2840587遗传平衡定律 rs76477312和rs2840587基因型均符合哈迪-温伯格遗传平衡定律(χ2=1.27、0.50，P=0.26、0.48)，表明该研究对象具有群体代表性。

2.2LINC01133 基因多态性位点基因型和等位基因频率分布 rs76477312主要以基因型CC和等位基因C为主，分别占69.0%和83.4%；rs2840587主要以基因型TT和等位基因T为主，分别占94.3%和97.1%，比较广西壮族人群不同性别间rs76477312、rs2840587基因型和等位基因频率，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、2。

表1 广西壮族人群LINC01133基因rs76477312基因型和等位基因频率分布[n(%)]

表2 广西壮族人群LINC01133基因rs2840587基因型和等位基因频率分布[n(%)]

2.3不同人群的LINC01133 基因多态性位点基因型和等位基因频率分布 广西壮族人群rs76477312基因型频率与美国和欧洲人群比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而与日本和南亚人群比较，差异无统计学意义(P>0.05)；广西壮族人群rs76477312等位基因频率与美国、日本和欧洲人群比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而与南亚人群比较，差异无统计学意义(P>0.05)。广西壮族人群rs2840587基因型和等位基因频率与美国、欧洲和南亚人群比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而与日本人群比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

表3 不同人群rs76477312基因型和等位基因频率分布[n(%)]

表4 不同人群rs2840587基因型和等位基因频率分布[n(%)]

3 讨 论

LINC01133是位于1q23.2号染色体的lncRNA，研究发现LINC01133降低肺鳞癌患者生存率且促进肺鳞癌细胞侵袭[11]。此外，LINC01133还促进胰腺癌和宫颈癌的发生、发展[12-13]。YANG等[10]研究发现，LINC01133在胃癌组织中呈低表达，并通过细胞功能学实验验证了LINC01133通过海绵mir-106a-3p调节APC基因的表达。KONG 等[14]发现，LINC01133抑制结直肠癌上皮间质转化和转移。SONG等[8]研究发现LINC01133在选自上海乳腺癌患者人群中呈低表达并与淋巴结转移和TNM分期呈负相关，并发现LINC01133在乳腺癌中通过EZH2基因下调SOX4的表达。TU等[15]研究表明，LINC01133促进三阴性乳腺癌肿瘤干细胞样特性和肿瘤生长，并对来自GEO数据库中的人群进行生存分析，提示LINC01133表达水平高的乳腺癌患者总体生产率更低，该结果与SONG等[8]的研究结果不一致，其可能的原因是所选择群体的遗传差异等。基因多态性直接影响基因的表达水平、基因突变可能导致不同人群对疾病易感性、疾病严重程度和治疗方案存在差异。因此，从分子水平上探讨基因多态性在不同人群中的分布情况尤为重要。

本研究结果表明，在广西壮族人群中，rs76477312存在GG、GC和CC基因型，其频率分别为2.1%、28.9%和69.0%，两等位基因G和C频率分别为16.6%和83.4%；rs2840587存在TT和TC两种基因型，其频率分别为94.3%和5.7%，其两等位基因T和C频率分别为97.1%和2.9%，两基因多态性位点基因型均符合哈迪-温伯格遗传平衡定律。广西壮族人群不同性别间rs76477312、rs2840587基因型和等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示LINC01133基因多态性位点基因型和等位基因频率可能与性别无关。不同种族地区rs76477312、rs2840587基因型和等位基因频率比较，结果显示：广西壮族人群的rs76477312的基因型、等位基因频率与美国、欧洲人群比较，差异有统计学意义(P<0.05)；广西壮族人群的rs2840587的基因型、等位基因频率与美国、欧洲和南亚人群比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，不同人群LINC01133基因多态性位点rs76477312和rs2840587基因型和等位基因频率具有地区差异性，为后续LINC01133基因多态性在不同人群疾病易感性的研究提供理论基础，也为选择研究人群多元化的必要性提供理论依据。但本研究存在几点不足：(1)广西作为一个少数民族地区，本次研究所选人群均为壮族人群，未纳入广西其他少数民族进行分层分析；(2)本研究所选的人群均长期居住广西地区。因此，后续将进一步研究在不同人群中比较该两个基因多态性位点与疾病的关系并进行种族分层分析。