蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质化学成分及抗高尿酸血症活性研究△

王喻淇，刘子菡，王少平，王鹏飞，董凡，代龙，张加余*

1.滨州医学院 药学院，山东 烟台 264000；2.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；3.山西中医药大学 药学院，山西 晋中 030600

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是指由体内嘌呤核苷酸代谢紊乱和(或)尿酸(uric acid，UA)排泄障碍引起血尿酸水平升高的代谢性疾病[1-2]。目前，临床上治疗HUA一般使用别嘌醇片、非布司他、苯溴马隆等药物，通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性或促进UA排泄从而发挥降UA的作用。但是，这些药物在调控UA水平的同时会对其他内源性代谢过程产生不良影响。如苯溴马隆可导致慢性肝损伤等[3-5]，限制了其临床应用。目前依然缺乏可以治疗HUA的安全有效药物，因此寻找新的HUA治疗药物具有重要意义。

双向发酵技术是将药用真菌与中药材有机结合的复合型中药生产工艺。中药经发酵后可起到减毒(槐耳/乌头菌质)、增效(槐耳/黄芪菌质)、扩效(槐耳/板蓝根菌质)等作用[6-9]。黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao是常用的大宗中药品种，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效[10]。蝉花，亦即蝉拟青霉Paecilomycescicadae，是麦角菌科真菌大蝉草CordycepscicadaeShing寄生于蝉科昆虫山蝉CicadafiammataDist.若虫上的子座及若虫尸体的复合体，是一种具有悠久药用历史的名贵真菌，具有很强的免疫调节和抗肿瘤活性[11-12]。鉴于临床常以补肾健脾、清热利湿及活血化瘀类中药治疗HUA，本研究取黄芪和蝉拟青霉配伍组合的补脾益肾之功，利用双向发酵技术优化制备蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质，阐明菌质中有效成分含量的变化，并采用氧嗪酸钾盐诱导大鼠HUA模型，初步评价双向发酵菌质的抗HUA作用，以期优化黄芪药效并为临床治疗HUA的新药研发提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体质量220～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 试药

蝉拟青霉(编号：cfcc81169)由中国林业微生物保藏中心提供；黄芪药材购于北京本草方源药业集团有限公司，经北京中医药大学张媛副教授鉴定为蒙古黄芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根；氧嗪酸钾盐购自美国Sigma公司；苯溴马隆片(Narcarin)购自德国Excella GmbH公司，批号：1707134；对照品芦丁(批号：17122001，纯度≥98.0%)购于成都曼思特生物科技有限公司；对照品无水葡萄糖(批号：140648-201804，纯度≥98.0%)购自中国食品药品检定研究院；定标液、质控液和检测试剂盒购于北京利德曼生化技术有限公司产品；总胆固醇(total cholesterol，TC)测定试剂盒(批号：00110)、三酰甘油(triglyceride，TG)测定试剂盒(批号：112293K)、UA测定试剂盒(批号：00275)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)测定试剂盒(批号：01049)、肌酐(creatinine，CRE)测定试剂盒(批号：04210)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)试剂盒(批号：00612)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)试剂盒(批号：01192)购于北京利德曼生化技术有限公司。

1.3 仪器

CX-4 Pro型全自动生化分析仪(美国Beckman公司)；R200D型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超纯水机(美国Millipore公司)；BXM-30R 型高压蒸汽灭菌锅(西安仪创实验室仪器设备有限公司)；UV-2000型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；FW-100型高速粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；LHS-80HC-Ⅱ型恒温恒湿培养箱(上海一恒科技有限公司)。

2 方法

2.1 蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质的制备

2.1.1菌种活化与液体培养 将蝉拟青霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基上，置于27 ℃、相对湿度80%的恒温恒湿箱活化培养5 d，备用。用接种环挑取活化后的蝉拟青霉置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，25 ℃、140 r·min-1的摇床条件下培养7 d备用。

2.1.2双向发酵菌质的制备 黄芪药材粉碎后过100目筛。取粉末50 g置于500 mL锥形瓶，加入蒸馏水至250 g混合搅拌均匀，向混合液中添加0.3%纤维素酶和0.3%果胶酶，于50 ℃下酶解90 min，放入121 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌30 min，得黄芪提取液；将黄芪提取液冷却至室温，接种10 mL蝉拟青霉种子液，在28 ℃、120 r·min-1的摇床条件下培养7 d，即得蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质。

2.1.3黄芪提取液、双向发酵菌质中化学成分含量测定 取黄芪提取液、双向发酵菌质各10 mL，离心后吸取上清液，加入无水乙醇反复倾倒数次，静置过夜后再次离心，沉淀加入80%无水乙醇混匀，静置10 min，5500 r·min-1离心5 min(离心半径10 cm)，弃去上清液，沉淀加水加热溶解后定容，采用蒽酮-硫酸比色法[13]测定样品粗多糖和总糖的含量。取黄芪提取液、双向发酵菌质各10 mL，离心后吸取上清液，采用乙酸乙酯反复萃取，得黄芪提取液、黄芪菌质中的总黄酮，并利用NaNO2-A1(NO3)3比色法[14]测定总黄酮含量。采用酸碱滴定法测定黄芪提取液、双向发酵菌质中的总酸。每份样品平行测定3次，取平均值。

2.2 模型制备及给药

56只SD大鼠按体质量随机分为对照组、HUA模型组、苯溴马隆组、黄芪双向发酵菌质(以下简称“菌质”)低剂量组、菌质高剂量组、黄芪低剂量组和黄芪高剂量组，每组8只。动物房适应性饲养1周后用于实验。各组均给予正常饲料喂养，对照组灌胃给予蒸馏水；其余各组每天灌胃氧嗪酸钾盐300 mg·kg-1造模。造模后1 h，阳性对照组灌胃苯溴马隆20 mg·kg-1，菌质低剂量组和高剂量组分别灌胃给予150、300 mg·kg-1(以黄芪生药量计)双向发酵菌质，黄芪低剂量组和高剂量组分别灌胃给予150、300 mg·kg-1(以黄芪生药量计)黄芪提取液；连续给药14 d，每天2次，灌胃量均为15 mL·kg-1。

2.3 血清样品的收集

最后一次给药后4 h，大鼠进行眼眶静脉丛取血。血样于4 ℃静置过夜，离心取血清，用于生化指标的测定。

2.4 生化指标测定

采用全自动生化分析仪在常规定标、质量控制后，检测血清中UA、TC、TG、CRE、BUN、ALT及AST水平。

2.5 数据分析

3 结果与讨论

3.1 菌质中成分的含量变化

采用无水葡萄糖为对照品，在620 nm处测定吸光度(A)值，以A值(Y)对浓度进行线性回归，得回归方程：Y=0.011 9X+0.002 5(r=0.998 5)。结果表明，与黄芪提取液比较，双向发酵菌质的总多糖含量明显增加，为黄芪提取液的1.37倍。采用芦丁为对照品，在510 nm处测定A值，以A值对浓度进行线性回归，得回归方程：Y=13.839X+0.029 7(r=0.999 8)。结果表明，与黄芪提取液比较，双向发酵菌质总黄酮的含量明显下降，仅为黄芪提取液的1/3。采用酸碱滴定法，用已知浓度的NaOH溶液滴定黄芪提取液及双向发酵菌质溶液，结果表明总酸的含量变化并不明显(见表1)。

表1 黄芪经发酵后成分含量变化 mg·mL-1

3.2 菌质对HUA大鼠血清UA水平的影响

如图1所示，与对照组比较，氧嗪酸钾盐诱导的HUA模型组大鼠血清UA水平显著升高(P<0.001)，提示模型制备成功。与模型组比较，阳性药苯溴马隆组，菌质低、高剂量组及黄芪低、高剂量组均显著降低了大鼠血清UA水平(P<0.001)。其中，菌质组与黄芪组降UA的作用效果均优于苯溴马隆组，菌质高剂量组的作用效果最强，优于黄芪高剂量组(P<0.05)，菌质低剂量组与黄芪低剂量组效果无明显差异。

注：与对照组比较，***P<0.001；与模型组比较，+++P<0.001；与菌质高剂量组比较，#P<0.05。图1 各组大鼠血清UA水平

3.3 菌质对HUA大鼠血脂指标的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠血清TC和TG水平显著升高(P<0.05，P<0.001)。与模型组比较，苯溴马隆仅能降低血清TG水平(P<0.01)；菌质低、高剂量组及黄芪低、高剂量均能显著降低模型大鼠血清TC和TG水平(P<0.05，P<0.01)。同时，随着剂量在一定范围内的增加，菌质组及黄芪组的调脂作用也随之增强。

注：与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001；与模型组比较，+P<0.05，++P<0.01。图2 各组大鼠血脂指标

3.4 菌质对HUA大鼠肾功能指标的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清BUN水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，菌质低、高剂量及黄芪高剂量均能够显著降低模型大鼠血清BUN水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；苯溴马隆对血清BUN水平无明显影响。此外，各组大鼠CRE水平无明显差异。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001。图3 各组大鼠血清肾功能指标

3.5 菌质对HUA大鼠肝功能指标的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠血清ALT和AST水平显著升高(P<0.05，P<0.001)。与模型组比较，菌质高剂量组及黄芪高剂量组均能够明显降低大鼠血清ALT和AST水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，且菌质高剂量组药效作用最强，明显优于黄芪高剂量组(P<0.05)。而苯溴马隆组大鼠血清ALT和AST水平均明显升高，ALT水平甚至高于模型组。

注：与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001；与模型组比较，+P<0.05，++P<0.01，+++P<0.001；与菌质高剂量组比较，#P<0.05。图4 各组大鼠血清肝功能指标

4 讨论

黄芪可用于治疗脾肺气虚、气虚自汗、气血亏虚及气虚血肿症。取其健脾之功，可助脾气升清，运化输布水谷精微，使水气输布得当，减少体内水液停聚，从而降低体内UA水平。以“高尿酸血症”和“治疗”为关键词，选取中医学、中药学、中西医结合条件进行CNKI检索，并对包含中药治疗的文献进行药味统计，结果发现，黄芪用药频次为67次，用药频率为26.8%，位居第7位[15]。传统医学研究发现，HUA所引起的并发症痛风发病日久，伤及肝脾肾，多用健脾柔肝、补肾固本之品。临床上常取黄芪益气补脾、健脾利湿之功，用于HUA的干预治疗。现代研究表明，黄芪具有胰岛素增敏作用且明显改善胰岛素抵抗对UA的影响[16]。此外，以黄芪为主要药味的黄芪四妙散[17]、黄芪桂枝五物汤[18]等方剂对HUA具有较好的疗效。同样，蝉花也具有降低血、尿CRE水平，提高内生CRE清除率，改善血清蛋白含量，减少尿蛋白的排出等功效，具有一定的降UA作用[19]，在以蝉花为君药的蝉花汤延缓慢性肾功能衰竭进展的临床研究中也发现类似功效[20]。基于此，本研究以蝉拟青霉作为发酵菌株，黄芪作为药性基质，采用新型双向液体发酵技术，在一定的优化条件下制备所得的发酵菌质具有显著的抗HUA活性，为UA治疗的新药研发工作提供了新的思路。

实验结果表明，菌质中各活性物质水平明显变化，主要包括多糖类和黄酮类物质。几种活性成分总量分析结果表明，发酵处理后的菌质中总多糖水平上升，说明蝉拟青霉不断代谢产生的纤维素酶类物质可破坏黄芪药材的细胞壁，分解细胞壁中的纤维素、木质素等物质，促进黄芪多糖的溶出[21]；同时，黄芪也促进了蝉拟青霉的生长、分裂和发育，促进其胞外多糖的分泌，从而提高了菌质中多糖的水平。同时，发酵处理后的菌质总黄酮含量下降，其可能的原因是在发酵过程中，蝉拟青霉不仅能合成黄酮类化合物同时还可分解黄酮类化合物，但其分解的速度大于合成的速度，因此导致总黄酮水平下降。

本课题组前期采用UHPLC-LTQ-Orbitrap对比分析了黄芪双向发酵前后的化学成分，结合色谱保留行为、相对分子质量、碎片离子及相关文献报道，共分析鉴定了107个化学成分，其中包括42个皂苷和65个黄酮类成分。发酵前后皂苷类成分由42个降至29个，部分皂苷(乙酰化或长链皂苷，如异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ)的含量大幅减少，次生苷或苷元类成分的含量上升明显；黄酮类成分则由47个上升到52个，部分黄酮苷(如毛蕊异黄酮苷和染料木苷)的含量大幅下降。这表明，苷类在发酵过程中易被代谢成次生苷或苷元，导致极性减小，脂溶性增加，从而提高了其在人体的生物利用度，利于其药效的发挥[22]，与已知文献报道相一致[23]，充分体现了中药发酵可以使其活性成分较大限度释放的优点。

HUA在我国的发病率呈逐年上升趋势，是代谢紊乱的重要标志。临床研究发现，约82%的HUA患者并发高甘油三酯血症，且发病率呈逐年上升趋势[24]；在健康人群中血清UA水平与TG水平也呈正相关[25]。本实验采用灌胃氧嗪酸钾盐诱导HUA模型，造模简单有效。连续灌胃氧嗪酸钾盐2周后，模型组大鼠血清中UA、BUN、ALT、AST、TC及TG水平均显著高于对照组，说明氧嗪酸钾盐诱导大鼠产生了HUA模型，并伴随着高甘油三酯症和肝肾功能损伤。

血清UA水平是HUA重要的临床指标，本实验发现灌胃给予黄芪提取液及蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质150、300 mg·kg-1能显著降低模型大鼠血清UA水平，且菌质高剂量降UA作用显著高于黄芪高剂量，两者作用效果均强于阳性药苯溴马隆。同时，菌质组和黄芪组大鼠血清TC和TG水平显著降低，减少了高甘油三酯症患病风险。

血清中的ALT、AST、BUN及CRE水平为衡量肝肾功能的重要指标。本实验中，大鼠连续灌胃氧嗪酸钾后，与对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST、BUN及CRE水平均显著升高，说明氧嗪酸钾盐诱导大鼠产生了肝肾损伤。研究结果表明，苯溴马隆虽能够降低氧嗪酸钾诱导的大鼠血清UA水平，但对ALT、AST、BUN及CRE水平无影响。而黄芪高剂量及菌质高剂量能够显著降低血清ALT、AST及BUN水平，且菌质组作用效果明显优于黄芪组，尤其是血清AST水平。

基于上述实验结果，黄芪经蝉拟青霉发酵后所得蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质对氧嗪酸钾诱导的HUA模型大鼠血清UA水平具有显著的降低作用，对模型大鼠血脂水平及肝肾功能具有一定的干预作用，且作用效果优于黄芪单药。本研究为开发抗HUA中药新药、减少HUA并发症、整体改善机体代谢紊乱状态提供了依据。